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熒光染料
Release Time：2022-09-21熒光顯微鏡的一個(gè)基本原理是在熒光劑的幫助下對(duì)細(xì)胞成分進(jìn)行高度特異性的可視化。這可以是一種熒光蛋白——例如 GFP——在基因上與感興趣的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。如果克隆是不可能的——例如在組織學(xué)樣本中——使用免疫熒光染色等技術(shù)來(lái)可視化感興趣的蛋白質(zhì)。為此，使用了與不同熒光染料連接并直接或間接與適當(dāng)目標(biāo)結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體。在熒光染料的幫助下，熒光顯微鏡不僅限于蛋白質(zhì)，還可用于檢測(cè)核酸、聚糖和其他結(jié)構(gòu)。甚至可以使用特定應(yīng)用的各種活細(xì)胞染料，這些染料允許使用細(xì)胞器選擇性染色（例如 ER、線粒體、高爾基體）或功能測(cè)定（例如，例如活細(xì)胞追蹤、標(biāo)記、細(xì)胞增殖或活死細(xì)胞測(cè)定，其中熒光是讀出方式。甚至可以檢測(cè)到鈣離子等非生物物質(zhì)。本文介紹了常用的熒光劑。
免疫熒光
在熒光顯微鏡中，有兩種方法可以顯示您感興趣的蛋白質(zhì)。要么借助內(nèi)在熒光信號(hào)——通過(guò)將熒光蛋白與靶蛋白進(jìn)行基因連接——要么借助與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。對(duì)于一些生物學(xué)問(wèn)題，執(zhí)行后一個(gè)問(wèn)題更有用甚至是必要的。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，不可能使用熒光蛋白，因?yàn)橥ǔ颖緛?lái)自不含有任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)快得多，在熒光蛋白技術(shù)中，您必須克隆感興趣的基因并將 DNA 轉(zhuǎn)染到足夠的細(xì)胞中。熒光蛋白的另一個(gè)缺點(diǎn)在于它們本身就是蛋白質(zhì)的性質(zhì)。有了它，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)具有特定的蛋白質(zhì)特征，這可能導(dǎo)致功能障礙或?qū)λ街母信d趣蛋白質(zhì)的誤解。然而，應(yīng)該考慮使用熒光蛋白通常是研究活細(xì)胞的首選方法。
免疫熒光利用抗體對(duì)其抗原的非常特異性的結(jié)合親和力。這可以有兩種不同的外觀。最簡(jiǎn)單的方法是使用一種與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這稱為直接免疫熒光。
在大多數(shù)情況下，使用兩種形式的抗體。第一個(gè)與目標(biāo)蛋白結(jié)合，本身沒(méi)有熒光標(biāo)記（一抗）。但是與一抗結(jié)合的第二種抗體（二抗）特異性地?cái)y帶熒光染料。這種方法稱為間接免疫熒光，具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一方面存在放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢挂环N二抗與一種一抗結(jié)合。另一方面，通常比用普通熒光染料標(biāo)記的特異性一抗更容易找到二抗。下面，我們回顧一下最常用的熒光染料。
FITC 和 TRITC
異硫氰酸熒光素 (FITC) 是一種有機(jī)熒光染料，可能是免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中最常用的染料之一。 它在 495/517 nm 處有一個(gè)激發(fā)/發(fā)射峰，并且可以借助其與蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑基、酪氨酰基或羰基結(jié)合的反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)與不同的抗體偶聯(lián)。 FITC（是最早用于熒光顯微術(shù)的染料之一，也是 Alexa Fluor®488 等其他熒光染料的前體。它的熒光活性是由于其大的共軛芳族電子系統(tǒng)，可被藍(lán)色光激發(fā) 光譜。
1.果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC，紅色：TRITC。
一種經(jīng)常與 FITC 結(jié)合使用的染料是 TRITC（四甲基羅丹明-5-（和 6）-異硫氰酸酯）。 與 FITC 不同，TRITC 不是熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。 羅丹明也有一個(gè)大的共軛芳香電子系統(tǒng)，這導(dǎo)致了它們的熒光行為。 TRITC 被綠色光譜中的光激發(fā)，最大波長(zhǎng)為 550 nm。 其發(fā)射最大值位于 573 nm。 與蛋白質(zhì)（例如抗體）的結(jié)合也基于反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)。
盡管 FITC 和 TRITC 仍被廣泛使用，但它們是相當(dāng)弱的熒光染料，不推薦用于最先進(jìn)的顯微鏡檢查。
花青染料
Alexa Fluor® 染料是一大類帶負(fù)電荷的親水性熒光染料，常用于熒光顯微術(shù)。 所有 Alexa Fluor® 染料都是不同堿性熒光物質(zhì)的磺化形式，如熒光素、香豆素、花青或羅丹明（例如 Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）。 在它們的標(biāo)簽中提到了各自的激光激發(fā)波長(zhǎng)。 例如，最常用的染料之一 Alexa Fluor®488 的最大激發(fā)波長(zhǎng)為 493 nm，允許使用標(biāo)準(zhǔn) 488 nm 激光進(jìn)行激發(fā)，而 Alexa Fluor®488 的最大發(fā)射波長(zhǎng)為 519 nm，它是一種熒光素衍生物和 具有與 FITC 相似的特性。 然而，它顯示出更好的穩(wěn)定性、亮度和更低的 pH 敏感性。
2. 小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎，中間體，E10.5小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎的五個(gè)中間體：EpaxisMyf5 eGFP； 對(duì) GFP-Alexa 488 進(jìn)行免疫染色； 胚胎肌纖維用 Desmin-Cy3 染色，細(xì)胞核從上到下顯示為 Hoechst 尺寸：3.5 mm (a), 800 µm (b)。 禮貌：Aurélie Jory, Cellules Souches et Développement, Institut Pasteur, Paris, France 和 IGBMC, IGBMC 影像中心
3.小鼠成纖維細(xì)胞，綠色：F-Actin，F(xiàn)ITC，紅色：Tubulin，Cy5，藍(lán)色：Nuclei，DAPI。
DNA染色
您可能想使用熒光顯微鏡研究核酸。例如，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞核來(lái)定義細(xì)胞的確切位置或數(shù)量。最常見(jiàn)的 DNA 染色劑之一是 DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），它與 DNA 雙螺旋的富含 A-T 的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合狀態(tài)相比，如果連接到 DNA 上，DAPI 熒光強(qiáng)度會(huì)增加。它被最大波長(zhǎng)為 358 nm 的紫外光激發(fā)。發(fā)射光譜很寬，峰值在 461 nm。對(duì)于 RNA 結(jié)合，也可以檢測(cè)到微弱的熒光。在這種情況下，發(fā)射移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠滲透完整的質(zhì)膜，使其對(duì)固定細(xì)胞和活細(xì)胞有用。
第二種廣泛使用的 DNA 染色選項(xiàng)是 Hoechst 染料系列。 Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是具有向 A-T 富集區(qū)域插入趨勢(shì)的雙苯并亞胺。與 DAPI 類似，它們被紫外光激發(fā)并在 455 nm 處具有最大發(fā)射，在未結(jié)合條件下移動(dòng)到 510–540 nm。 Hoechst 染料還具有細(xì)胞滲透性，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。它們的毒性低于 DAPI。
不透膜的 DNA 染色劑是碘化丙啶，通常用于區(qū)分細(xì)胞培養(yǎng)物中的活細(xì)胞和死細(xì)胞，因?yàn)樗荒苓M(jìn)入??完整細(xì)胞。碘化丙啶也是一種嵌入劑，但對(duì)不同的堿基沒(méi)有結(jié)合偏好。在核酸結(jié)合狀態(tài)下，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為 538 nm。最高發(fā)射波長(zhǎng)為 617 nm。未結(jié)合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射最大值移動(dòng)到較低的波長(zhǎng)和較低的強(qiáng)度。它還可以在不改變其熒光特性的情況下與 RNA 結(jié)合。為了區(qū)分 DNA 和 RNA，有必要使用足夠的核酸酶。
一種無(wú)需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之間產(chǎn)生差異的染料是吖啶橙。它的最大激發(fā)/發(fā)射對(duì)在 DNA 結(jié)合狀態(tài)下為 502 nm/525 nm，在 RNA 結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?460 nm/650 nm。此外，它可以進(jìn)入酸性區(qū)室，如陽(yáng)離子染料質(zhì)子化的溶酶體。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙被藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強(qiáng)。它通常用于識(shí)別凋亡細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冇泻芏啾煌淌傻乃嵝愿糸g
區(qū)室和細(xì)胞器特異性染料
有許多特定的染料可用于研究細(xì)胞區(qū)室，例如溶酶體、內(nèi)體或細(xì)胞器，例如線粒體。
一種眾所周知的觀察線粒體的方法是使用 MitoTracker®。這是一種細(xì)胞滲透性染料，具有溫和的硫醇反應(yīng)性氯甲基部分，用于通過(guò)與半胱氨酸殘基的游離硫醇基團(tuán)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合基質(zhì)蛋白。 MitoTracker® 以不同的顏色和修飾形式存在（見(jiàn)表 1）。與羅丹明 123 或四甲基玫瑰胺等常規(guī)線粒體特異性染色劑相比，MitoTracker® 在用固定劑破壞膜電位后不會(huì)被洗掉。
LysoTracker 是一組不同顏色的染料，用于染色溶酶體等酸性隔室。這些是與熒光團(tuán)連接的可滲透膜的弱堿基。由于質(zhì)子化，這些堿很可能對(duì)酸性區(qū)室具有親和力（見(jiàn)表 1）。
與溶酶體相當(dāng)?shù)母羰沂轻劸平湍傅日婢械囊号?。這種膜封閉空間也是酸性的。在熒光顯微鏡中觀察它的一種方法是使用苯乙烯基染料，如 FM 4-64® 或 FM 5-95®。
在研究蛋白質(zhì)分泌時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 通常會(huì)被染色。一種經(jīng)典的染色該隔室的染料是 DiOC6(3)，它對(duì) ER 有偏好，但仍與線粒體等其他膜結(jié)合。另一種專門染色 ER 的方法是使用 ER-Tracker，例如 ER-Tracker Green 和 ER-Tracker Red。兩者都是基于 BODIPY 的染料，它們與格列本脲（一種磺酰脲酶）相連，它與僅駐留在 ER 膜中的 ATP 敏感鉀通道結(jié)合。 BODIPY（硼-二吡咯亞甲基）描述了一組幾乎不溶于水的相對(duì) pH 不敏感的染料。這使它們成為脂質(zhì)和膜標(biāo)記的非常好的工具。
4. 浦肯野細(xì)胞，小鼠小腦皮質(zhì)的三重標(biāo)記旁矢狀切面。 紅色：抗鈣結(jié)合蛋白-D28k/Cy3，綠色：抗 GFAP/Cy5，藍(lán)色：Hoechst 33258。
與 ER 相鄰的隔間 - 高爾基體 - 可以用熒光神經(jīng)酰胺類似物標(biāo)記，如 NBD C6-神經(jīng)酰胺和 BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺。 神經(jīng)酰胺是高爾基體中高度富集的鞘脂。
借助其他基于脂質(zhì)的染料，可以對(duì)特殊的膜區(qū)域（如脂質(zhì)筏）進(jìn)行染色。 這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)使用 NBD-6 膽固醇或 NBP-12 膽固醇等（Avanti Polar Lipids）來(lái)可視化。
還可以借助對(duì)細(xì)胞中不同位置的偏好的蛋白質(zhì)對(duì)感興趣的區(qū)域進(jìn)行染色。 一個(gè)例子是使用小麥胚芽凝集素 (WGA)，它與質(zhì)膜中存在的唾液酸和 N-乙酰氨基葡糖特異性結(jié)合。
離子成像
在神經(jīng)元研究、基因活動(dòng)或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的情況下，研究細(xì)胞的離子濃度是有意義的。鈉、鈣、氯或鎂離子對(duì)許多不同的細(xì)胞事件有深遠(yuǎn)的影響。通常，離子可以在熒光標(biāo)記的螯合劑的幫助下被捕獲，這些螯合劑在與適當(dāng)?shù)碾x子結(jié)合時(shí)會(huì)改變它們的光譜特性。標(biāo)記螯合劑的一個(gè)例子是鈣指示劑 fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4 和 Calcium-Green。對(duì)于鈉檢測(cè)，通常使用 SBFI（鈉結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸酯）或鈉綠。 PBFI（鉀結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸酯）檢測(cè)鉀離子。
功能分析
“功能測(cè)定”是一個(gè)廣義術(shù)語(yǔ)，用于涵蓋標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估可以用熒光標(biāo)記物可視化的各種功能。這些標(biāo)記可以包括但不限于任何上述標(biāo)記技術(shù)和熒光團(tuán)。對(duì)于許多這些功能性分析，染色試劑盒是市售的，可以很容易地應(yīng)用于各種各樣的樣品。功能測(cè)定的一個(gè)例子是眾所周知的和廣泛使用的活死測(cè)定。兩個(gè)熒光團(tuán)用于標(biāo)記活細(xì)胞和死細(xì)胞。掌握這兩個(gè)值，就可以評(píng)估細(xì)胞的整體健康狀況。將此信息與其他標(biāo)記相關(guān)聯(lián)甚至可以增加對(duì)基本過(guò)程的理解。
熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)
下表顯示了熒光染料的完整列表及其各自的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)峰值。請(qǐng)注意，除了這些峰之外，每種染料都具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中選擇幾種染料組合使用時(shí)，研究人員應(yīng)注意由于串?dāng)_（或滲漏）導(dǎo)致的重疊激發(fā)和發(fā)射光譜，這可能導(dǎo)致假陰性或陽(yáng)性，或以其他方式模糊數(shù)據(jù)。另一個(gè)可以扭曲熒光成像的來(lái)源是細(xì)胞和組織中天然存在的熒光蛋白產(chǎn)生的自發(fā)熒光，這在植物或藻類的實(shí)驗(yàn)中尤其需要考慮。充分了解樣品中所用染料的光譜對(duì)于選擇合適的激發(fā)光源（例如 LED、弧光燈、激光線）以及合適的發(fā)??射濾光片和檢測(cè)器也很重要。
6.Alexa 488（綠色曲線）和Alexa 555（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。 兩個(gè)發(fā)射光譜的重疊是顯而易見(jiàn)的。 紅線表示 488 發(fā)射濾波器的帶通。
表1-熒光染料
免疫熒光
在熒光顯微鏡中，有兩種方法可以顯示您感興趣的蛋白質(zhì)。要么借助內(nèi)在熒光信號(hào)——通過(guò)將熒光蛋白與靶蛋白進(jìn)行基因連接——要么借助與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。對(duì)于一些生物學(xué)問(wèn)題，執(zhí)行后一個(gè)問(wèn)題更有用甚至是必要的。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，不可能使用熒光蛋白，因?yàn)橥ǔ颖緛?lái)自不含有任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)快得多，在熒光蛋白技術(shù)中，您必須克隆感興趣的基因并將 DNA 轉(zhuǎn)染到足夠的細(xì)胞中。熒光蛋白的另一個(gè)缺點(diǎn)在于它們本身就是蛋白質(zhì)的性質(zhì)。有了它，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)具有特定的蛋白質(zhì)特征，這可能導(dǎo)致功能障礙或?qū)λ街母信d趣蛋白質(zhì)的誤解。然而，應(yīng)該考慮使用熒光蛋白通常是研究活細(xì)胞的首選方法。
免疫熒光利用抗體對(duì)其抗原的非常特異性的結(jié)合親和力。這可以有兩種不同的外觀。最簡(jiǎn)單的方法是使用一種與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這稱為直接免疫熒光。
在大多數(shù)情況下，使用兩種形式的抗體。第一個(gè)與目標(biāo)蛋白結(jié)合，本身沒(méi)有熒光標(biāo)記（一抗）。但是與一抗結(jié)合的第二種抗體（二抗）特異性地?cái)y帶熒光染料。這種方法稱為間接免疫熒光，具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一方面存在放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢挂环N二抗與一種一抗結(jié)合。另一方面，通常比用普通熒光染料標(biāo)記的特異性一抗更容易找到二抗。下面，我們回顧一下最常用的熒光染料。
FITC 和 TRITC
異硫氰酸熒光素 (FITC) 是一種有機(jī)熒光染料，可能是免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中最常用的染料之一。 它在 495/517 nm 處有一個(gè)激發(fā)/發(fā)射峰，并且可以借助其與蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑基、酪氨酰基或羰基結(jié)合的反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)與不同的抗體偶聯(lián)。 FITC（是最早用于熒光顯微術(shù)的染料之一，也是 Alexa Fluor®488 等其他熒光染料的前體。它的熒光活性是由于其大的共軛芳族電子系統(tǒng)，可被藍(lán)色光激發(fā) 光譜。
1.果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC，紅色：TRITC。
一種經(jīng)常與 FITC 結(jié)合使用的染料是 TRITC（四甲基羅丹明-5-（和 6）-異硫氰酸酯）。 與 FITC 不同，TRITC 不是熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。 羅丹明也有一個(gè)大的共軛芳香電子系統(tǒng)，這導(dǎo)致了它們的熒光行為。 TRITC 被綠色光譜中的光激發(fā)，最大波長(zhǎng)為 550 nm。 其發(fā)射最大值位于 573 nm。 與蛋白質(zhì)（例如抗體）的結(jié)合也基于反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)。
盡管 FITC 和 TRITC 仍被廣泛使用，但它們是相當(dāng)弱的熒光染料，不推薦用于最先進(jìn)的顯微鏡檢查。
花青染料
Alexa Fluor® 染料是一大類帶負(fù)電荷的親水性熒光染料，常用于熒光顯微術(shù)。 所有 Alexa Fluor® 染料都是不同堿性熒光物質(zhì)的磺化形式，如熒光素、香豆素、花青或羅丹明（例如 Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）。 在它們的標(biāo)簽中提到了各自的激光激發(fā)波長(zhǎng)。 例如，最常用的染料之一 Alexa Fluor®488 的最大激發(fā)波長(zhǎng)為 493 nm，允許使用標(biāo)準(zhǔn) 488 nm 激光進(jìn)行激發(fā)，而 Alexa Fluor®488 的最大發(fā)射波長(zhǎng)為 519 nm，它是一種熒光素衍生物和 具有與 FITC 相似的特性。 然而，它顯示出更好的穩(wěn)定性、亮度和更低的 pH 敏感性。
2. 小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎，中間體，E10.5小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎的五個(gè)中間體：EpaxisMyf5 eGFP； 對(duì) GFP-Alexa 488 進(jìn)行免疫染色； 胚胎肌纖維用 Desmin-Cy3 染色，細(xì)胞核從上到下顯示為 Hoechst 尺寸：3.5 mm (a), 800 µm (b)。 禮貌：Aurélie Jory, Cellules Souches et Développement, Institut Pasteur, Paris, France 和 IGBMC, IGBMC 影像中心
3.小鼠成纖維細(xì)胞，綠色：F-Actin，F(xiàn)ITC，紅色：Tubulin，Cy5，藍(lán)色：Nuclei，DAPI。
DNA染色
您可能想使用熒光顯微鏡研究核酸。例如，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞核來(lái)定義細(xì)胞的確切位置或數(shù)量。最常見(jiàn)的 DNA 染色劑之一是 DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），它與 DNA 雙螺旋的富含 A-T 的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合狀態(tài)相比，如果連接到 DNA 上，DAPI 熒光強(qiáng)度會(huì)增加。它被最大波長(zhǎng)為 358 nm 的紫外光激發(fā)。發(fā)射光譜很寬，峰值在 461 nm。對(duì)于 RNA 結(jié)合，也可以檢測(cè)到微弱的熒光。在這種情況下，發(fā)射移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠滲透完整的質(zhì)膜，使其對(duì)固定細(xì)胞和活細(xì)胞有用。
第二種廣泛使用的 DNA 染色選項(xiàng)是 Hoechst 染料系列。 Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是具有向 A-T 富集區(qū)域插入趨勢(shì)的雙苯并亞胺。與 DAPI 類似，它們被紫外光激發(fā)并在 455 nm 處具有最大發(fā)射，在未結(jié)合條件下移動(dòng)到 510–540 nm。 Hoechst 染料還具有細(xì)胞滲透性，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。它們的毒性低于 DAPI。
不透膜的 DNA 染色劑是碘化丙啶，通常用于區(qū)分細(xì)胞培養(yǎng)物中的活細(xì)胞和死細(xì)胞，因?yàn)樗荒苓M(jìn)入??完整細(xì)胞。碘化丙啶也是一種嵌入劑，但對(duì)不同的堿基沒(méi)有結(jié)合偏好。在核酸結(jié)合狀態(tài)下，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為 538 nm。最高發(fā)射波長(zhǎng)為 617 nm。未結(jié)合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射最大值移動(dòng)到較低的波長(zhǎng)和較低的強(qiáng)度。它還可以在不改變其熒光特性的情況下與 RNA 結(jié)合。為了區(qū)分 DNA 和 RNA，有必要使用足夠的核酸酶。
一種無(wú)需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之間產(chǎn)生差異的染料是吖啶橙。它的最大激發(fā)/發(fā)射對(duì)在 DNA 結(jié)合狀態(tài)下為 502 nm/525 nm，在 RNA 結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?460 nm/650 nm。此外，它可以進(jìn)入酸性區(qū)室，如陽(yáng)離子染料質(zhì)子化的溶酶體。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙被藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強(qiáng)。它通常用于識(shí)別凋亡細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冇泻芏啾煌淌傻乃嵝愿糸g
區(qū)室和細(xì)胞器特異性染料
有許多特定的染料可用于研究細(xì)胞區(qū)室，例如溶酶體、內(nèi)體或細(xì)胞器，例如線粒體。
一種眾所周知的觀察線粒體的方法是使用 MitoTracker®。這是一種細(xì)胞滲透性染料，具有溫和的硫醇反應(yīng)性氯甲基部分，用于通過(guò)與半胱氨酸殘基的游離硫醇基團(tuán)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合基質(zhì)蛋白。 MitoTracker® 以不同的顏色和修飾形式存在（見(jiàn)表 1）。與羅丹明 123 或四甲基玫瑰胺等常規(guī)線粒體特異性染色劑相比，MitoTracker® 在用固定劑破壞膜電位后不會(huì)被洗掉。
LysoTracker 是一組不同顏色的染料，用于染色溶酶體等酸性隔室。這些是與熒光團(tuán)連接的可滲透膜的弱堿基。由于質(zhì)子化，這些堿很可能對(duì)酸性區(qū)室具有親和力（見(jiàn)表 1）。
與溶酶體相當(dāng)?shù)母羰沂轻劸平湍傅日婢械囊号?。這種膜封閉空間也是酸性的。在熒光顯微鏡中觀察它的一種方法是使用苯乙烯基染料，如 FM 4-64® 或 FM 5-95®。
在研究蛋白質(zhì)分泌時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 通常會(huì)被染色。一種經(jīng)典的染色該隔室的染料是 DiOC6(3)，它對(duì) ER 有偏好，但仍與線粒體等其他膜結(jié)合。另一種專門染色 ER 的方法是使用 ER-Tracker，例如 ER-Tracker Green 和 ER-Tracker Red。兩者都是基于 BODIPY 的染料，它們與格列本脲（一種磺酰脲酶）相連，它與僅駐留在 ER 膜中的 ATP 敏感鉀通道結(jié)合。 BODIPY（硼-二吡咯亞甲基）描述了一組幾乎不溶于水的相對(duì) pH 不敏感的染料。這使它們成為脂質(zhì)和膜標(biāo)記的非常好的工具。
4. 浦肯野細(xì)胞，小鼠小腦皮質(zhì)的三重標(biāo)記旁矢狀切面。 紅色：抗鈣結(jié)合蛋白-D28k/Cy3，綠色：抗 GFAP/Cy5，藍(lán)色：Hoechst 33258。
與 ER 相鄰的隔間 - 高爾基體 - 可以用熒光神經(jīng)酰胺類似物標(biāo)記，如 NBD C6-神經(jīng)酰胺和 BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺。 神經(jīng)酰胺是高爾基體中高度富集的鞘脂。
借助其他基于脂質(zhì)的染料，可以對(duì)特殊的膜區(qū)域（如脂質(zhì)筏）進(jìn)行染色。 這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)使用 NBD-6 膽固醇或 NBP-12 膽固醇等（Avanti Polar Lipids）來(lái)可視化。
還可以借助對(duì)細(xì)胞中不同位置的偏好的蛋白質(zhì)對(duì)感興趣的區(qū)域進(jìn)行染色。 一個(gè)例子是使用小麥胚芽凝集素 (WGA)，它與質(zhì)膜中存在的唾液酸和 N-乙酰氨基葡糖特異性結(jié)合。
離子成像
在神經(jīng)元研究、基因活動(dòng)或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的情況下，研究細(xì)胞的離子濃度是有意義的。鈉、鈣、氯或鎂離子對(duì)許多不同的細(xì)胞事件有深遠(yuǎn)的影響。通常，離子可以在熒光標(biāo)記的螯合劑的幫助下被捕獲，這些螯合劑在與適當(dāng)?shù)碾x子結(jié)合時(shí)會(huì)改變它們的光譜特性。標(biāo)記螯合劑的一個(gè)例子是鈣指示劑 fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4 和 Calcium-Green。對(duì)于鈉檢測(cè)，通常使用 SBFI（鈉結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸酯）或鈉綠。 PBFI（鉀結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸酯）檢測(cè)鉀離子。
功能分析
“功能測(cè)定”是一個(gè)廣義術(shù)語(yǔ)，用于涵蓋標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估可以用熒光標(biāo)記物可視化的各種功能。這些標(biāo)記可以包括但不限于任何上述標(biāo)記技術(shù)和熒光團(tuán)。對(duì)于許多這些功能性分析，染色試劑盒是市售的，可以很容易地應(yīng)用于各種各樣的樣品。功能測(cè)定的一個(gè)例子是眾所周知的和廣泛使用的活死測(cè)定。兩個(gè)熒光團(tuán)用于標(biāo)記活細(xì)胞和死細(xì)胞。掌握這兩個(gè)值，就可以評(píng)估細(xì)胞的整體健康狀況。將此信息與其他標(biāo)記相關(guān)聯(lián)甚至可以增加對(duì)基本過(guò)程的理解。
熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)
下表顯示了熒光染料的完整列表及其各自的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)峰值。請(qǐng)注意，除了這些峰之外，每種染料都具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中選擇幾種染料組合使用時(shí)，研究人員應(yīng)注意由于串?dāng)_（或滲漏）導(dǎo)致的重疊激發(fā)和發(fā)射光譜，這可能導(dǎo)致假陰性或陽(yáng)性，或以其他方式模糊數(shù)據(jù)。另一個(gè)可以扭曲熒光成像的來(lái)源是細(xì)胞和組織中天然存在的熒光蛋白產(chǎn)生的自發(fā)熒光，這在植物或藻類的實(shí)驗(yàn)中尤其需要考慮。充分了解樣品中所用染料的光譜對(duì)于選擇合適的激發(fā)光源（例如 LED、弧光燈、激光線）以及合適的發(fā)??射濾光片和檢測(cè)器也很重要。
6.Alexa 488（綠色曲線）和Alexa 555（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。 兩個(gè)發(fā)射光譜的重疊是顯而易見(jiàn)的。 紅線表示 488 發(fā)射濾波器的帶通。
表1-熒光染料
| 熒光染料產(chǎn)品 | Excitation | Emission |
| Indo-1, Ca saturated | 331 nm | 404 nm |
| Indo-1 Ca2+ | 346 nm | 404 nm |
| Cascade Blue BSA pH 7.0 | 401 nm | 419 nm |
| Cascade Blue | 398 nm | 420 nm |
| LysoTracker Blue | 373 nm | 421 nm |
| Alexa 405 | 401 nm | 421 nm |
| LysoSensor Blue pH 5.0 | 374 nm | 424 nm |
| LysoSensor Blue | 374 nm | 424 nm |
| DyLight 405 | 399 nm | 434 nm |
| DyLight 350 | 332 nm | 435 nm |
| BFP (Blue Fluorescent Protein) | 380 nm | 439 nm |
| Alexa 350 | 343 nm | 441 nm |
| 7-Amino-4-methylcoumarin pH 7.0 | 346 nm | 442 nm |
| Amino Coumarin | 345 nm | 442 nm |
| AMCA conjugate | 347 nm | 444 nm |
| Coumarin | 360 nm | 447 nm |
| 7-Hydroxy-4-methylcoumarin | 360 nm | 447 nm |
| 7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0 | 361 nm | 448 nm |
| 6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0 | 358 nm | 450 nm |
| Hoechst 33342 | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue | 404 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258 | 352 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258-DNA | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue antibody conjugate pH 8.0 | 404 nm | 455 nm |
| PO-PRO-1 | 434 nm | 457 nm |
| PO-PRO-1-DNA | 435 nm | 457 nm |
| POPO-1 | 433 nm | 457 nm |
| POPO-1-DNA | 433 nm | 458 nm |
| DAPI-DNA | 359 nm | 461 nm |
| DAPI | 358 nm | 463 nm |
| Marina Blue | 362 nm | 464 nm |
| SYTOX Blue-DNA | 445 nm | 470 nm |
| CFP (Cyan Fluorescent Protein) | 434 nm | 474 nm |
| eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein) | 437 nm | 476 nm |
| 1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS) | 375 nm | 479 nm |
| Indo-1, Ca free | 346 nm | 479 nm |
| 1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid) | 375 nm | 480 nm |
| BO-PRO-1-DNA | 462 nm | 482 nm |
| BOPRO-1 | 462 nm | 482 nm |
| BOBO-1-DNA | 461 nm | 484 nm |
| SYTO 45-DNA | 451 nm | 486 nm |
| evoglow-Pp1 | 448 nm | 495 nm |
| evoglow-Bs1 | 448 nm | 496 nm |
| evoglow-Bs2 | 448 nm | 496 nm |
| Auramine O | 431 nm | 501 nm |
| DiO | 487 nm | 501 nm |
| LysoSensor Green pH 5.0 | 447 nm | 502 nm |
| Cy 2 | 489 nm | 503 nm |
| LysoSensor Green | 447 nm | 504 nm |
| Fura-2, high Ca | 336 nm | 504 nm |
| Fura-2 Ca2+sup> | 336 nm | 505 nm |
| SYTO 13-DNA | 488 nm | 506 nm |
| YO-PRO-1-DNA | 491 nm | 507 nm |
| YOYO-1-DNA | 491 nm | 509 nm |
| eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) | 488 nm | 509 nm |
| LysoTracker Green | 503 nm | 509 nm |
| GFP聽(tīng)(S65T) | 489 nm | 509 nm |
| BODIPY FL, MeOH | 502 nm | 511 nm |
| Sapphire | 396 nm | 511 nm |
| BODIPY FL conjugate | 503 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green | 490 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green FM, MeOH | 490 nm | 512 nm |
| Fluorescein 0.1 M NaOH | 493 nm | 513 nm |
| Calcein pH 9.0 | 494 nm | 514 nm |
| Fluorescein pH 9.0 | 490 nm | 514 nm |
| Calcein | 493 nm | 514 nm |
| Fura-2, no Ca | 367 nm | 515 nm |
| Fluo-4 | 494 nm | 516 nm |
| FDA | 495 nm | 517 nm |
| DTAF | 495 nm | 517 nm |
| Fluorescein | 495 nm | 517 nm |
| Fluorescein antibody conjugate pH 8.0 | 493 nm | 517 nm |
| CFDA | 495 nm | 517 nm |
| FITC | 495 nm | 517 nm |
| Alexa Fluor 488 hydrazide-water | 493 nm | 518 nm |
| DyLight 488 | 493 nm | 518 nm |
| 5-FAM pH 9.0 | 492 nm | 518 nm |
| FITC聽(tīng)antibody conjugate pH 8.0 | 495 nm | 519 nm |
| Alexa 488 | 493 nm | 520 nm |
| Rhodamine 110 | 497 nm | 520 nm |
| Rhodamine 110 pH 7.0 | 497 nm | 520 nm |
| Acridine Orange | 431 nm | 520 nm |
| Alexa Fluor 488 antibody conjugate pH 8.0 | 499 nm | 520 nm |
| BCECF pH 5.5 | 485 nm | 521 nm |
| PicoGreendsDNA quantitation reagent | 502 nm | 522 nm |
| SYBR Green I | 498 nm | 522 nm |
| Rhodaminen Green pH 7.0 | 497 nm | 523 nm |
| CyQUANT GR-DNA | 502 nm | 523 nm |
| NeuroTrace 500/525, green fluorescent Nissl stain-RNA | 497 nm | 524 nm |
| DansylCadaverine | 335 nm | 524 nm |
| Rhodol Green antibody conjugate pH 8.0 | 499 nm | 524 nm |
| Fluoro-Emerald | 495 nm | 524 nm |
| Nissl | 497 nm | 524 nm |
| Fluorescein dextran pH 8.0 | 501 nm | 524 nm |
| Rhodamine Green | 497 nm | 524 nm |
| 5-(and-6)-Carboxy-2', 7'-dichlorofluorescein pH 9.0 | 504 nm | 525 nm |
| DansylCadaverine, MeOH | 335 nm | 526 nm |
| eYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) | 514 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488 | 498 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488 antibody conjugate pH 8.0 | 498 nm | 526 nm |
| Fluo-3 | 506 nm | 527 nm |
| BCECF pH 9.0 | 501 nm | 527 nm |
| SBFI-Na+ | 336 nm | 527 nm |
| Fluo-3 Ca2+ | 506 nm | 527 nm |
| Rhodamine 123, MeOH | 507 nm | 529 nm |
| FlAsH | 509 nm | 529 nm |
| Calcium Green-1 Ca2+ | 506 nm | 529 nm |
| Magnesium Green | 507 nm | 530 nm |
| DM-NERF pH 4.0 | 493 nm | 530 nm |
| Calcium Green | 506 nm | 530 nm |
| Citrine | 515 nm | 530 nm |
| LysoSensor Yellow pH 9.0 | 335 nm | 530 nm |
| TO-PRO-1-DNA | 515 nm | 531 nm |
| Magnesium Green Mg2+ | 507 nm | 531 nm |
| Sodium Green Na+ | 507 nm | 531 nm |
| TOTO-1-DNA | 514 nm | 531 nm |
| Oregon Green 514 | 512 nm | 532 nm |
| Oregon Green 514 antibody conjugate pH 8.0 | 513 nm | 533 nm |
| NBD-X | 466 nm | 534 nm |
| DM-NERF pH 7.0 | 509 nm | 537 nm |
| NBD-X, MeOH | 467 nm | 538 nm |
| CI-NERF pH 6.0 | 513 nm | 538 nm |
| Alexa 430 | 431 nm | 540 nm |
| Alexa Fluor 430 antibody conjugate pH 7.2 | 431 nm | 540 nm |
| CI-NERF pH 2.5 | 504 nm | 541 nm |
| Lucifer Yellow, CH | 428 nm | 542 nm |
| LysoSensor Yellow pH 3.0 | 389 nm | 542 nm |
| 6-TET, SE pH 9.0 | 521 nm | 542 nm |
| Eosin antibody conjugate pH 8.0 | 525 nm | 546 nm |
| Eosin | 524 nm | 546 nm |
| 6-Carboxyrhodamine 6G pH 7.0 | 526 nm | 547 nm |
| 6-Carboxyrhodamine 6G, hydrochloride | 525 nm | 547 nm |
| Bodipy R6G SE | 528 nm | 547 nm |
| BODIPY R6G, MeOH | 528 nm | 547 nm |
| 6 JOE | 520 nm | 548 nm |
| Cascade Yellow antibody conjugate pH 8.0 | 399 nm | 549 nm |
| Cascade Yellow | 399 nm | 549 nm |
| mBanana | 540 nm | 553 nm |
| Alexa Fluor 532 antibody conjugate pH 7.2 | 528 nm | 553 nm |
| Alexa 532 | 528 nm | 553 nm |
| Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0 | 533 nm | 554 nm |
| 6-HEX, SE pH 9.0 | 534 nm | 559 nm |
| mOrange | 548 nm | 562 nm |
| mHoneydew | 478 nm | 562 nm |
| Cy 3 | 549 nm | 562 nm |
| Rhodamine B | 543 nm | 565 nm |
| DiI | 551 nm | 565 nm |
| 5-TAMRA-MeOH | 543 nm | 567 nm |
| Alexa 555 | 553 nm | 568 nm |
| Alexa Fluor 555 antibody conjugate pH 7.2 | 553 nm | 568 nm |
| DyLight 549 | 555 nm | 569 nm |
| BODIPY TMR-X, SE | 544 nm | 570 nm |
| BODIPY TMR-X, MeOH | 544 nm | 570 nm |
| PO-PRO-3-DNA | 539 nm | 571 nm |
| PO-PRO-3 | 539 nm | 571 nm |
| Rhodamine | 551 nm | 573 nm |
| Bodipy TMR-X conjugate | 544 nm | 573 nm |
| POPO-3 | 533 nm | 573 nm |
| Alexa 546 | 562 nm | 573 nm |
| BODIPY TMR-X antibody conjugate pH 7.2 | 544 nm | 573 nm |
| Calcium Orange Ca2+ | 549 nm | 573 nm |
| TRITC | 550 nm | 573 nm |
| Calcium Orange | 549 nm | 574 nm |
| Rhodaminephalloidin pH 7.0 | 558 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange | 551 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange, MeOH | 551 nm | 575 nm |
| Phycoerythrin | 565 nm | 575 nm |
| Magnesium Orange | 550 nm | 575 nm |
| R-Phycoerythrin pH 7.5 | 565 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA pH 7.0 | 553 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA | 549 nm | 577 nm |
| Rhod-2 | 552 nm | 577 nm |
| FM 1-43 | 472 nm | 578 nm |
| Rhod-2 Ca2+ | 553 nm | 578 nm |
| Tetramethylrhodamine antibody conjugate pH 8.0 | 552 nm | 578 nm |
| FM 1-43 lipid | 473 nm | 579 nm |
| LOLO-1-DNA | 568 nm | 580 nm |
| dTomato | 554 nm | 581 nm |
| DsRed | 563 nm | 581 nm |
| Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide | 372 nm | 582 nm |
| Tetramethylrhodamine dextran pH 7.0 | 555 nm | 582 nm |
| Fluor-Ruby | 554 nm | 582 nm |
| Resorufin | 571 nm | 584 nm |
| Resorufin pH 9.0 | 571 nm | 584 nm |
| mTangerine | 568 nm | 585 nm |
| LysoTracker Red | 578 nm | 589 nm |
| Lissaminerhodamine | 572 nm | 590 nm |
| Cy 3.5 | 578 nm | 591 nm |
| Rhodamine Red-X antibody conjugate pH 8.0 | 573 nm | 591 nm |
| Sulforhodamine 101, EtOH | 578 nm | 593 nm |
| JC-1 pH 8.2 | 593 nm | 595 nm |
| JC-1 | 592 nm | 595 nm |
| mStrawberry | 575 nm | 596 nm |
| MitoTracker Red | 578 nm | 599 nm |
| MitoTracker Red, MeOH | 578 nm | 599 nm |
| X-Rhod-1 Ca2+ | 580 nm | 602 nm |
| Alexa Fluor 568 antibody conjugate pH 7.2 | 579 nm | 603 nm |
| Alexa 568 | 576 nm | 603 nm |
| 5-ROX pH 7.0 | 578 nm | 604 nm |
| 5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt) | 578 nm | 604 nm |
| BO-PRO-3-DNA | 574 nm | 604 nm |
| BOPRO-3 | 574 nm | 604 nm |
| BOBO-3-DNA | 570 nm | 605 nm |
| Ethidium Bromide | 524 nm | 605 nm |
| ReAsH | 597 nm | 608 nm |
| Calcium Crimson | 589 nm | 608 nm |
| Calcium Crimson Ca2+ | 590 nm | 608 nm |
| mRFP | 585 nm | 608 nm |
| mCherry | 587 nm | 610 nm |
| Texas Red-X antibody conjugate pH 7.2 | 596 nm | 613 nm |
| HcRed | 590 nm | 614 nm |
| DyLight 594 | 592 nm | 616 nm |
| Ethidium homodimer-1-DNA | 528 nm | 617 nm |
| Ethidiumhomodimer | 528 nm | 617 nm |
| Propidium Iodide | 538 nm | 617 nm |
| SYPRO Ruby | 467 nm | 618 nm |
| Propidium Iodide-DNA | 538 nm | 619 nm |
| Alexa 594 | 590 nm | 619 nm |
| BODIPY TR-X, SE | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X, MeOH | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X phallacidin pH 7.0 | 590 nm | 621 nm |
| Alexa Fluor 610 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2 | 567 nm | 627 nm |
| YO-PRO-3-DNA | 613 nm | 629 nm |
| Di-8 ANEPPS | 469 nm | 630 nm |
| Di-8-ANEPPS-lipid | 469 nm | 631 nm |
| YOYO-3-DNA | 612 nm | 631 nm |
| Nile Red-lipid | 553 nm | 636 nm |
| Nile Red | 559 nm | 637 nm |
| DyLight 633 | 624 nm | 646 nm |
| mPlum | 587 nm | 649 nm |
| TO-PRO-3-DNA | 642 nm | 657 nm |
| DDAO pH 9.0 | 648 nm | 657 nm |
| Fura Red, high Ca | 434 nm | 659 nm |
| Allophycocyanin pH 7.5 | 651 nm | 660 nm |
| APC (allophycocyanin) | 650 nm | 660 nm |
| Nile Blue, EtOH | 631 nm | 660 nm |
| TOTO-3-DNA | 642 nm | 661 nm |
| Cy 5 | 646 nm | 664 nm |
| BODIPY 650/665-X, MeOH | 646 nm | 664 nm |
| Alexa Fluor 647 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2 | 569 nm | 666 nm |
| DyLight 649 | 652 nm | 668 nm |
| Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2 | 653 nm | 668 nm |
| Alexa 647 | 653 nm | 669 nm |
| Fura Red Ca2+ | 435 nm | 670 nm |
| Atto 647 | 644 nm | 670 nm |
| Fura Red, low Ca | 472 nm | 673 nm |
| Carboxynaphthofluorescein pH 10.0 | 600 nm | 674 nm |
| Alexa 660 | 664 nm | 691 nm |
| Alexa Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2 | 663 nm | 691 nm |
| Cy 5.5 | 673 nm | 692 nm |
| Alexa Fluor 680 antibody conjugate pH 7.2 | 679 nm | 702 nm |
| Alexa 680 | 679 nm | 703 nm |
| DyLight 680 | 678 nm | 706 nm |
| Alexa Fluor 700 antibody conjugate pH 7.2 | 696 nm | 719 nm |
| Alexa 700 | 696 nm | 720 nm |
| FM 4-64, 2% CHAPS | 506 nm | 751 nm |
| FM 4-64 | 508 nm | 751 nm |
