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裂解和蛋白提取
Release Time：2022-09-19當(dāng)純化的蛋白質(zhì)用于功能或結(jié)構(gòu)研究，或用于制備加工和生產(chǎn)時(shí)，首先要做的是破壞細(xì)胞或組織以獲得目的蛋白質(zhì)。 細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)溶解是高效分析和高效處理的關(guān)鍵步驟。 提取方法包括酶法、化學(xué)法、機(jī)械法或幾種方法的組合。
有多種方法可用于破壞細(xì)胞并準(zhǔn)備??其內(nèi)容物以供分析。通常，當(dāng)樣品由易于裂解的培養(yǎng)細(xì)胞或血細(xì)胞組成時(shí)，使用較溫和的方法，而更積極的方法用于破壞更堅(jiān)固的細(xì)菌或植物細(xì)胞，或嵌入結(jié)締組織中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
※ 表面活性劑裂解方法：基于去污劑的裂解：去污劑裂解是一種較溫和的方法，適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母和植物。將細(xì)胞懸液輕輕離心并重懸于含有去污劑的裂解緩沖液中，去污劑可用于破壞細(xì)胞膜。溶解細(xì)胞膜，裂解細(xì)胞并釋放其內(nèi)容物。如果去污劑干擾分析或生產(chǎn)，則需要在下游處理中去除它們。
※ 凍融裂解法：該方法適用于哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液用液氮速凍。然后將樣品解凍并通過移液或在裂解緩沖液中輕輕渦旋重新懸浮，并重復(fù)此過程數(shù)次。在循環(huán)之間，將樣品離心并保留含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液。
※ 滲透休克法：這是一種非常溫和的方法，無(wú)需使用表面活性劑即可裂解懸浮的哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞。這種方法通常與機(jī)械破碎技術(shù)相結(jié)合，依賴于從高滲透性介質(zhì)到低滲透性介質(zhì)的變化，非常適合隨后將裂解物分餾成亞細(xì)胞級(jí)分的應(yīng)用。
※ 超聲處理：這種蛋白質(zhì)提取方法最常用于細(xì)胞懸液。將探針插入樣品中，細(xì)胞會(huì)被高頻聲波破壞。聲波產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂的低壓區(qū)域。
※ 機(jī)械破碎技術(shù)：各種粗略但有效的“破碎和研磨”措施可用于從細(xì)胞和組織中提取蛋白質(zhì)。例如，液體剪切力可用于使用 Dounce 或 Potter-Elvehjem 均質(zhì)化方法破壞細(xì)胞膜。使用 Waring 攪拌器或 Polytron® 均質(zhì)器在冷卻的緩沖液中切碎或研磨組織來均質(zhì)化組織。在液氮中冷凍組織或細(xì)胞，加入氧化鋁或沙子，用研缽和研杵研磨成細(xì)粉。快速攪拌細(xì)胞和小玻璃珠會(huì)破壞細(xì)胞壁，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌有效。
※ 酶法：酶法通常用于從細(xì)菌、酵母或真核細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，這些細(xì)胞被包裹在纖維組織中，細(xì)胞膜被強(qiáng)大的保護(hù)結(jié)構(gòu)包圍。溶菌酶（Lysozyme）、變?nèi)芫兀∕utanolysin）、MetaPolyzyme六種酶混合物、溶菌酶和鏈霉蛋白酶（Pronase）等細(xì)胞溶解酶或混合物可與組織消化酶（即膠原酶、軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶）結(jié)合使用，用于溶解或破壞僅通過機(jī)械方法無(wú)法輕易裂解的結(jié)構(gòu)，例如細(xì)胞壁、殼、膠囊、衣殼等。酶促裂解后，均質(zhì)化、超聲處理或劇烈渦旋通常在裂解緩沖液中進(jìn)行。
此外，由于細(xì)胞破碎會(huì)釋放內(nèi)源性蛋白酶和磷酸酶并降解靶蛋白，因此應(yīng)保護(hù)樣品在細(xì)胞破碎和隨后使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑純化期間不會(huì)失控地丟失靶蛋白。
