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溴化乙錠染色
Release Time：2022-09-23溴化乙錠簡(jiǎn)介：
溴化乙錠(1239-45-8,Ethidium bromide,EB)簡(jiǎn)稱EB,是用于凝膠中DNA和RNA檢測(cè)的最常用染料。溴化乙錠是一種DNA嵌入劑，可將自身插入雙螺旋的堿基對(duì)之間。溴化乙錠在300和360nm處具有最大的UV吸收，在590nm處具有最大的發(fā)射紅橙信號(hào)。溴化乙錠（EB）也是一種嵌入藥物，已顯示可阻止雌激素受體（R）與DNA的體外相互作用。
溴化乙錠是一種敏感、易染色的 DNA。它產(chǎn)生低背景和 1-5 ng/band 的檢測(cè)限。溴化乙錠的主要缺點(diǎn)是它是一種有效的誘變劑。解決方案必須極其謹(jǐn)慎地處理，并在處置前進(jìn)行凈化。盡管如此，溴化乙錠染色的敏感性、簡(jiǎn)單性（如果需要，染料可以在凝膠中與 DNA 一起運(yùn)行，消除了單獨(dú)的染色/脫色過(guò)程）和非破壞性特性，使其成為雙鏈 DNA 的標(biāo)準(zhǔn)染色劑。
重要的是要注意，天然 DNA 的雙鏈結(jié)構(gòu)強(qiáng)烈增強(qiáng)了乙錠染色。變性、ssDNA 或 RNA 的染色相對(duì)不敏感，需要大約 10 倍的核酸才能進(jìn)行等效檢測(cè)。另一個(gè)限制是乙錠的熒光被聚丙烯酰胺淬滅，在 PAGE 凝膠中靈敏度降低了 10-20 倍。
使用溴化乙錠檢測(cè) DNA/RNA
注意：溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑，只能使用手套和適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施進(jìn)行處理。
方法 I - 在凝膠和緩沖液中加入溴化乙錠
※ 凝膠制備
-- 根據(jù)制備瓊脂糖凝膠的標(biāo)準(zhǔn)方案將瓊脂糖溶解在緩沖液中。
-- 讓凝膠冷卻至 60-70°C。
-- 添加 EtBr 至 0.5 µg/ml 最終濃度。 （原液一般為 10 mg/ml，需要 5μl 原液/100ml 凝膠）。
-- 倒入凝膠并照常放置。
※ 緩沖液準(zhǔn)備
-- 準(zhǔn)備足夠的緩沖液（TBE 或 TAE）來(lái)填充設(shè)備。
-- 添加 5µl/100ml EtBr 原液。
※ 運(yùn)行凝膠
運(yùn)行完成后，將凝膠置于 UV 燈箱上的保鮮膜中。在微弱的橙色背景上，條帶將顯示為亮橙色。
這種方法將檢測(cè)大約 5ng 的 DNA?？赡苄枰谒谢?1 mM MgSO4 中脫色以達(dá)到完全靈敏度。
作為替代方案，乙錠可以包含在凝膠中，但不包含在緩沖液中。乙錠帶正電荷，會(huì)從 DNA 向相反的方向遷移。通常，即使在 DNA 凝膠的陰極端，仍有足夠的乙錠與 DNA 結(jié)合。這種凝膠將具有高背景區(qū)域，其中乙錠尚未遷移出凝膠。然而，它們足以滿足多種用途，并且不會(huì)產(chǎn)生那么多的乙錠廢物（您的安全辦公室會(huì)知道什么水平的乙錠會(huì)導(dǎo)致緩沖液被宣布為危險(xiǎn)品）。
二、方法 II - 運(yùn)行后染色
※ 在水或緩沖液中準(zhǔn)備足夠的 0.5µg/ml EtBr 以完全浸沒(méi)凝膠。該溶液在室溫下避光保存 1-2 個(gè)月。
※ 運(yùn)行后將凝膠浸入染色溶液中 15-30 分鐘（取決于凝膠厚度）。
※ 將凝膠放在 UV 燈箱上的保鮮膜上，并在 300nm 照明下觀察。條帶將在淡橙色背景上顯示為亮橙色。
【注意事項(xiàng)】：
※ 該方法最大限度地減少了每次凝膠運(yùn)行產(chǎn)生的溴化乙錠廢物量。
※ 靈敏度與方法 I 相同，可能需要在水中或 1mM MgSO4 中脫色以達(dá)到最佳靈敏度。
※ 在這種方法中，隨著染料擴(kuò)散到基質(zhì)中，從凝膠的頂部和底部可以看到條帶。通過(guò)浸泡凝膠直到條帶的頂部和底部出現(xiàn)，然后將凝膠從染色溶液中取出 15-30 分鐘，通?？梢栽诓幻撋那闆r下獲得高對(duì)比度結(jié)果。在此期間，染色劑將繼續(xù)擴(kuò)散到凝膠中，以犧牲游離染料為代價(jià)與 DNA 結(jié)合。結(jié)果是沒(méi)有脫色的較低背景。
※ 始終在乙錠染色凝膠下使用保鮮膜，以避免陽(yáng)光照射損壞透照器表面。
