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溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)使用方法
Release Time：2022-09-29溴化乙錠使用注意事項(xiàng)
溴化乙錠是檢測 DNA/RNA 最常用的染料。溴化乙錠也是一種 DNA 螯合劑，可將自身插入雙螺旋堿基對之間的空間中。溴化乙錠在 300 和 360 nm 處具有最大紫外吸光度。此外，它還可以從 260 nm 輻射條件下吸收激發(fā)核苷酸中的能量。溴化乙錠在水溶液中的熒光明顯低于螯合染料。 溴化乙錠是一種敏感、易染色的 DNA。溴化乙錠的主要缺點(diǎn)是它是一種有效的誘變劑。實(shí)驗(yàn)方案中必須極其謹(jǐn)慎地處理，并在處置前進(jìn)行凈化。盡管如此，溴化乙錠染色的敏感性、簡單性（如果需要，染料可以在凝膠中與 DNA 一起運(yùn)行，消除了單獨(dú)的染色/脫色過程）和非破壞性特性，使其成為雙鏈 DNA 的標(biāo)準(zhǔn)染色劑。 重要的是要注意，天然 DNA 的雙鏈結(jié)構(gòu)強(qiáng)烈增強(qiáng)了溴化乙錠的染色。變性、ssDNA 或 RNA 的染色相對不敏感，需要大約 10 倍的核酸才能進(jìn)行等效檢測。
另一個(gè)限制是溴化乙錠的熒光被聚丙烯酰胺淬滅，在 PAGE 凝膠中靈敏度降低了 10-20 倍。
方法1-使用溴化乙錠檢測 DNA/RNA
※ 注意：溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑，只有穿戴好手套和在做好適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施條件下操作。
方法I - 在凝膠和緩沖液中加入溴化乙錠
1. 凝膠制備
※ 根據(jù)制備瓊脂糖凝膠的標(biāo)準(zhǔn)方案將瓊脂糖溶解在緩沖液中。
※ 讓凝膠冷卻至 60-70°C。
※ 添加 EtBr 至 0.5 µg/ml 最終濃度。 （原液一般為 10 mg/ml，需要 5μl 原液/100ml 凝膠）。
※ 倒入凝膠并照常放置。
2. 緩沖液準(zhǔn)備
※ 準(zhǔn)備足夠的緩沖液（TBE 或 TAE）來填充設(shè)備。
※ 添加 5µl/100ml EtBr 原液。
3. 跑膠
運(yùn)行凝膠
※ 跑完膠后，將凝膠置于 UV 燈箱上的保鮮膜中。在微弱的橙色背景上，條帶將顯示為亮橙色。
※ 這種方法將檢測大約 5ng 的 DNA。 可能需要在水中或 1 mM MgSO4 中脫色以達(dá)到完全靈敏度。
※ 作為替代方案，溴化乙錠可以包含在凝膠中，但不包含在緩沖液中。 溴化乙錠帶正電荷，會從 DNA 向相反的方向遷移。 通常，即使在凝膠的陰極端，仍有足夠的溴化乙錠與 DNA 結(jié)合，其中溴化乙錠尚未遷移出凝膠。 然而，它們足以滿足多種用途，并且不會產(chǎn)生太多的溴化乙錠廢棄物。
方法2-Post-Run Staining
※ 在水或緩沖液中準(zhǔn)備足夠的 0.5µg/ml EtBr 以完全浸沒凝膠。該溶液在室溫下避光保存 1-2 個(gè)月。
※ 運(yùn)行后將凝膠浸入染色溶液中 15-30 分鐘（取決于凝膠厚度）。
※ 將凝膠放在 UV 燈箱上的保鮮膜上，并在 300nm 照明下觀察。條帶將在淡橙色背景上顯示為亮橙色。
備注：
1. 該方法最大限度地減少了每次凝膠運(yùn)行產(chǎn)生的溴化乙錠廢物量。
2. 靈敏度與方法 I 相同，可能需要在水中或 1mM MgSO4 中脫色以達(dá)到最佳靈敏度。
3. 在改實(shí)驗(yàn)方法中，隨著染料擴(kuò)散到基質(zhì)中，從凝膠的頂部和底部可以看到條帶。 通過浸泡凝膠直到條帶的頂部和底部出現(xiàn)，然后將凝膠從染色溶液中取出 15-30 分鐘，通?？梢栽诓幻撋那闆r下獲得高對比度結(jié)果。 在此期間，染色劑將繼續(xù)擴(kuò)散到凝膠中，以犧牲游離染料為代價(jià)與 DNA 結(jié)合。 結(jié)果是沒有脫色，背景較低。
