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測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性
Release Time：2020-07-20一、測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介
二、測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性實(shí)驗(yàn)原理
02 - +02 - + 2H+ H2 02 +02，由于超氧陰離子自由基02的壽命短且不穩(wěn)定，因此不易直接測(cè)定SOD活性，因此使用間接方法。當(dāng)前有三種常用的方法，包括氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化學(xué)還原法，焦性沒(méi)食子酸自氧化法和化學(xué)發(fā)光法。本實(shí)驗(yàn)主要介紹光化學(xué)還原法。原理是：在蛋氨酸和核黃素存在下，氮藍(lán)四唑發(fā)生光化學(xué)還原反應(yīng)，生成藍(lán)色甲基hydr，藍(lán)色甲基blue在560nm處具有最大的光吸收率。
SOD可抑制NBT的光化學(xué)還原，其抑制強(qiáng)度與酶活性在一定范圍內(nèi)成正比。
三，測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性實(shí)驗(yàn)所需試劑：
1.50m mol / l pH 7.8的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。包含0.1m mol / l EDTA
2.220毫 摩/升甲硫氨酸：稱(chēng)3.2824克甲硫氨酸,用50毫 摩/升 pH7.8的磷酸緩沖液定溶至100ml（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
3.1.25m mol / l氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）溶液（現(xiàn)已制備）：稱(chēng)量NBT 0.102克，使用溶解50m mol / l pH 7.8的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），并稀釋至100ml。
4.0.033m mol / l核黃素：重2.52m克，用PBS溶解至200ml（儲(chǔ)存于陰涼處）。四，實(shí)驗(yàn)步驟
1.酶溶液的制備：稱(chēng)取0.5克植物組織，加入2.5ml PBS，研磨并勻漿，然后加入2.5ml PBS并充分混合。上清液在4℃以10000r / min離心15min后為粗酶溶液。適當(dāng)稀釋一部分上清液，用于酶活性測(cè)定。
2.酶活性測(cè)定取7個(gè)10毫升的小燒杯，3個(gè)測(cè)試樣品，4個(gè)作為對(duì)照，根據(jù)下表添加試劑：
| 所需試劑 | 試劑用量(ml ) | 最終濃度(比色時(shí)) |
| 50毫 摩/升 (PBS)
220毫 摩/升 Met 1.25毫 摩/升 NBT 0.033毫 摩/升核黃素 酶液 總體積 |
4.05
0.3 0.3 0.3 0.05 5.0 |
13毫 摩/升 75µ mol/l 2.0µ mol/l 對(duì)照以緩沖液代替酶液 |
3.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
將步驟1的上清液適當(dāng)稀釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò)考馬斯亮藍(lán)克-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
四，測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算
SOD活性的單位表示為抑制NBT的光化學(xué)還原的50％的酶活性單位?？梢酝ㄟ^(guò)計(jì)算SOD活性：
SOD總活性=SOD比活性=總SOD活性/總蛋白質(zhì)濃度
式中: SOD總活性單位：U/克FW,比活力單位：U/m克蛋白，ACK是對(duì)照品(光照)的光吸收數(shù)值;AE為樣品的光吸收數(shù)值;V為樣液總體積,V1為測(cè)定時(shí)樣品用量,W為樣品克重.
