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FerroOrange Fe2+檢測(cè)探針：
鐵是生物體內(nèi)最豐富的過(guò)渡金屬元素，它參與各種生理過(guò)程活動(dòng)。 近年來(lái)，活細(xì)胞中的游離鐵受到廣泛關(guān)注， 游離鐵最常以其穩(wěn)定的氧化還原態(tài)存在，即亞鐵離子 (Fe²⁺) 和鐵離子 (Fe³⁺)。對(duì)研究者來(lái)說(shuō)，在研究細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境，金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Fe²⁺的水溶性時(shí)，了解Fe²⁺的行為比了解Fe³⁺的行為更為重要。FerroOrange作為一種新型的熒光探針，可對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的Fe²⁺進(jìn)行熒光成像。

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FerroOrange,Fe2+檢測(cè)探針原理：
1. 特異性配位作用
FerroOrange分子中含有鄰菲羅啉（phenanthroline）衍生物或其他類(lèi)似配體，能夠與Fe²?形成穩(wěn)定的八面體絡(luò)合物。這種配位作用具有高度選擇性，僅與亞鐵離子（Fe²⁺）結(jié)合，而對(duì)三價(jià)鐵（Fe³⁺）和其他常見(jiàn)金屬離子（如Ca²⁺、Mg²⁺等）無(wú)明顯響應(yīng)。
2. 熒光信號(hào)變化
當(dāng)Fe²⁺與FerroOrange結(jié)合后，探針?lè)肿影l(fā)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）或結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著升高（“Turn-On”型響應(yīng)）。游離的FerroOrange本身熒光較弱，而結(jié)合Fe²⁺后熒光增強(qiáng)，可通過(guò)熒光光譜（如Ex/Em=543/580 nm）定量檢測(cè)Fe²⁺濃度。
3. 抗干擾設(shè)計(jì)
FerroOrange通常在弱酸性至中性條件（pH 4-7）下使用，此環(huán)境既抑制Fe²⁺的氧化（避免轉(zhuǎn)化為Fe³⁺），又減少其他金屬離子的干擾。部分配方可能含有抗氧化劑（如抗壞血酸）或掩蔽劑，進(jìn)一步提升檢測(cè)特異性。
4. 檢測(cè)靈敏度與線性范圍
其檢測(cè)限可達(dá)納摩爾級(jí)（nM），適用于細(xì)胞或生物樣品中微量Fe²⁺的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，例如研究細(xì)胞內(nèi)鐵代謝或氧化應(yīng)激過(guò)程。

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溶液制備
在含有24 μg FerroOrange的管中加入35μl DMSO，用移液器吹打混勻，配制得到1 mmol/l FerroOrange溶液。 用HBSS溶液稀釋1 mmol/l 的FerroOrange溶液，制備得到1 μmol/l 的FerroOrange工作液。
* DMF或乙醇也可以代替DMSO進(jìn)行制備。 該溶液在-20℃穩(wěn)定1個(gè)月。 1 μmol/l FerroOrange工作液不穩(wěn)定。需要現(xiàn)配現(xiàn)用，并盡快使用。
* 必要時(shí)，可使用無(wú)血清培養(yǎng)基代替HBSS，血清會(huì)增加背景。

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操作步驟
1.細(xì)胞接種于熒光培養(yǎng)皿中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。
2.棄去上清液，并用 HBSS 或 無(wú)血清培養(yǎng)基 洗滌細(xì)胞3次。
3.更換含有藥物的培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。
※ 根據(jù)藥物特性優(yōu)化孵育時(shí)間。
4.加入濃度為1 μmol/l的FerroOrange工作液，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。
※ 加入FerroOrange染色劑后請(qǐng)立即觀察，不要洗滌。
5.在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

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FerroOrange 產(chǎn)品特點(diǎn)：
※ 高靈敏度
※ 可以與其他染料共染
FerroOrange 產(chǎn)品規(guī)格：
※ 性狀：可溶于乙腈，甲醇和二甲基亞砜。
※ 純度（HPLC）：92.0%以上
※ 熒光光譜：符合一致性

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FerroOrange 實(shí)驗(yàn)案例：
HeLa cells treated with chelator of iron 2,2′-bipyridyl (Bpy) (100 μmol/L) or Ammonium iron (II) sulfate (100 μmol/L) were prepared. The change of intracellular Fe2+in HeLa cells was detected by the FerroOrange.
※ 熒光顯微鏡

Ex/Em = 561 nm/570-620 nm, Scale bars 20 μm
Left Control
Middle Ammonium iron (II) sulfate and 2,2′-Bipyridyl (Bpy) treated
Right Ammonium iron (II) sulfate treated
The fluorescence intensity of FerroOrange was increased in HeLa cells treated with Ammonium iron (II) sulfate compared with the findings in untreated cells; conversely, its fluorescence intensity was decreased in cells treated with Bpy.

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※ Plate Reader Assay

Ex/Em = 543 nm/ 580 nm
Left Control
Middle Ammonium iron (II) sulfate and 2,2′-Bipyridyl (Bpy) treated
Right Ammonium iron (II) sulfate treated
The change of intracellular Fe²⁺in HeLa cells was quantified by the FerroOrange.

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金屬離子選擇性

Ex/Em = 543 nm/ 580 nm
2 μL of 1 mmol/L FerroOrange and 2 μL of 10 mmol/L from each metal were added to 1 mL of 50 mmol/L HEPES Buffer (pH7.4). The fluorescence intensity was measured after the reaction, for 1hr, at room temperature.

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FerroOrange 應(yīng)用
1. 監(jiān)測(cè)亞細(xì)胞不穩(wěn)定Fe2+的高通量方法
FerroOrange 可用于活細(xì)胞中不穩(wěn)定的 Fe(II) 的基于 96 孔板的高含量成像。 在接下來(lái)的文章中，Hirayama 博士等人能夠?qū)Π?3399 種化合物的化學(xué)文庫(kù)進(jìn)行高通量篩選。
使用極其靈敏的熒光探針進(jìn)行高通量篩選以發(fā)現(xiàn)鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑
*FerroOrange 在參考文獻(xiàn)中被稱為“RhoNox-4”。
*FerroOrange 在 Hideko Nagasawa 博士和 Tasuku Hirayama 博士（岐阜藥科大學(xué)）的指導(dǎo)下商業(yè)化。
2. 鐵死亡研究中小鼠肝臟中亞鐵離子（Fe2+）的檢測(cè)
在以下文章中，使用 FerroOrange（Ferroptosis 研究）在小鼠肝臟中檢測(cè)到亞鐵離子 (Fe2+)。
* 以缺乏蛋氨酸膽堿的飲食喂養(yǎng)小鼠
Targeting Ferroptosis Alleviates Methionine-Choline Deficient (MCD)-diet Induced NASH by Suppressing Liver Lipotoxicity

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FerroOrange與各種細(xì)胞內(nèi)的染色試劑共染
用各種染色試劑染色HeLa細(xì)胞，清洗細(xì)胞。然后將FerroOrange添加到細(xì)胞中，并用熒光顯微鏡觀察。
與ER染色試劑共染 
※ 檢測(cè)條件
FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm
ER Tracker Green（ER染色試劑）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm
標(biāo)尺: 10 μm

 

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與線粒體染色試劑共染
※ 檢測(cè)條件
FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm
MitoBright Deep Red（線粒體染色試劑）: Ex: 640 nm、Em: 650-700 nm
標(biāo)尺: 10 μm

 

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與高爾基體染色試劑的共染
※ 檢測(cè)條件
FerroOrange: Ex: 561 nm、Em: 570-620 nm
BODIPY FL（高爾基體染色試劑）: Ex: 488 nm、Em: 510-555 nm
標(biāo)尺: 10 μm

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Excitation and Emission Spectra

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FerroOrange 常見(jiàn)問(wèn)題
1. FerroOrange只會(huì)檢測(cè)游離鐵嗎？還是某些如鐵硫蛋白里的結(jié)合鐵，都可以檢測(cè)嗎？
FerroOrange只檢測(cè)游離的二價(jià)鐵
2. 染色時(shí)需要注意什么？
※ FerroOrange染色后的對(duì)培養(yǎng)基的更換。
染色后無(wú)需清洗工作液，通常血清中含有鐵離子，請(qǐng)注意使用不含血清的培養(yǎng)基，所以染色后即使細(xì)胞外有殘留的FerroOrange，但是因?yàn)榧?xì)胞外沒(méi)有血清中鐵離子的影響，也不會(huì)產(chǎn)生背景熒光的問(wèn)題。
※ 細(xì)胞難以染色(靈敏度低)時(shí)的辦法。
根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)的不同，染色程度也有差異。
使FerroOrange working solution濃度高于推薦的1 µmol/l進(jìn)行染色。建議在1-5 µmol/l范圍內(nèi)染色。

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3. 使用熒光酶標(biāo)儀的操作步驟
樣品A：無(wú)添加劑(僅HeLa細(xì)胞)。
樣品B：添加了鐵螯合試劑2,2`-bipyridyl(Bpy)的HeLa細(xì)胞。
樣品C：添加鐵(硫酸銨鐵)的HeLa細(xì)胞。
<測(cè)量操作>。
1.在96孔黑板(透明底)上接種100 µl HeLa細(xì)胞懸液，使其達(dá)到10,000 cells/well，在37℃  5%CO2 培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。
2.樣品C的細(xì)胞用MEM(不含F(xiàn)BS)100 µl洗滌3次。
3.向樣品C中添加100 μl硫酸銨鐵(II)/MEM(不含F(xiàn)BS) (最終濃度: 100 µmol/l)，在37℃  5%CO2培養(yǎng)箱中靜置30分鐘。
4.用100 µl HBSS洗滌所有孔的細(xì)胞3次。
5.向樣品A和C中添加100 μl的1 µmol/l FerroOrange working solution ，向樣品B中添加100 μl含有FerroOrange(最終濃度:1 µmol/l)和Bpy(最終濃度:100 µmol/l)的HBSS溶液，在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘。
6.用多功能讀板器檢測(cè)各樣品的熒光強(qiáng)度(Ex:543 nm,Em:580 nm)。

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