配制 MitoTracker Deep Red FM 儲(chǔ)存液:

※ 是以粉末形式提供，使用前需產(chǎn)品回溫至室溫。

※ 之后使用細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的無水DMSO 將其充分溶解至終濃度1 mM。

※ 分子量：M. Wt.= 543.58 g/mol，換算下來，50 µg粉末只需加入92 µL DMSO即可得到1 mM儲(chǔ)存液。

※ 可根據(jù)單次的使用量將儲(chǔ)存液分裝后放到-20℃避光，避免反復(fù)凍融。

2. 配置工作液

※ 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂貌煌奶结槤舛?，以下的起始操作條件僅作參考，可根據(jù)細(xì)胞類型和其他的相關(guān)因素如細(xì)胞或組織的透化等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

※ 用適當(dāng)?shù)木彌_液或者細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋1 mM儲(chǔ)存液至工作液濃度。一般推薦使用濃度為25-500 nM。對(duì)于后續(xù)需要做固定或透化的樣本，推薦工作濃度為100-500 nM，為了降低過度加載導(dǎo)致的潛在偽影和線粒體毒性，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)。
※ 果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。另外，濃度過高也可能對(duì)其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色。

3. 染色及檢測(cè)

1）貼壁細(xì)胞的染色

培養(yǎng)皿/板內(nèi)加入適量的培養(yǎng)基覆蓋蓋玻片進(jìn)行爬片培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長至所需豐度，吸除培養(yǎng)液，加入37℃預(yù)熱的MitoTracker® Deep Red FM染色工作液。在所使用細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下孵育15-45 min（最佳孵育時(shí)間需優(yōu)化）。染色結(jié)束后，使用新鮮培養(yǎng)液或緩沖液替換上述染色液，即可將其置于熒光顯微鏡下觀察或熒光酶標(biāo)儀下讀數(shù)?；蛘哌M(jìn)行后續(xù)的固定和透化步驟，見步驟4。

2）懸浮細(xì)胞的染色

離心收集細(xì)胞，吸除上清，利用37℃預(yù)熱的MitoTracker® Deep Red FM染色工作液輕輕重懸細(xì)胞。在所使用細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下孵育15-45 min（最佳孵育時(shí)間需優(yōu)化）。染色結(jié)束后，離心收集細(xì)胞，利用37℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)液或緩沖液重懸細(xì)胞，被染色的細(xì)胞可用流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡進(jìn)行分析。

如果需要蓋玻片上固定化的細(xì)胞，那么可在鋪片前先用多聚賴氨酸（poly-D-lysine）包被載玻片或蓋玻片。

或者進(jìn)行后續(xù)的固定和透化步驟，見步驟4。

4. 固定和透化

1）染色結(jié)束后，利用培養(yǎng)液或緩沖液清洗細(xì)胞；

2）小心吸走清洗液。換用新鮮配制且預(yù)熱的含2-4%甲醛的緩沖液或培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞固定。

3）清洗細(xì)胞：吸除固定液，用適當(dāng)緩沖液沖洗細(xì)胞數(shù)次。

4）細(xì)胞透化（可選）：

像ICC等實(shí)驗(yàn)需要細(xì)胞要做透化，則可將已固定的細(xì)胞直接加入含有去污劑如Triton X-100的緩沖液中孵育。透化結(jié)束后，用緩沖液清洗細(xì)胞即可進(jìn)行后續(xù)ICC實(shí)驗(yàn)。經(jīng)檢測(cè)，利用含0.2% Triton X-100的PBS孵育內(nèi)皮細(xì)胞10 min可以達(dá)到良好的透化效果。

另外，還可利用預(yù)冷的丙酮透化5 min，之后用PBS清洗細(xì)胞。經(jīng)驗(yàn)證，即使后繼沒有進(jìn)一步的抗體標(biāo)記，丙酮透化處理也可降低背景信號(hào)。