檢測芬頓 (Fenton) 反應(yīng)所產(chǎn)生的羥自由基：

1. 將1.5 mg的BMPO溶解于5 ml的超純水。
2. 取15 μl的BMPO溶液，75 μl的1 mM的H₂O₂和75 μl的100 μM的FeSO₄加入到50 μl的超純水中。
3. 放置一段時間 (例如1 min) 將溶液轉(zhuǎn)入EPR樣品管中檢測。
4. 通過峰值計算相對強(qiáng)度。

檢測黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶體系 (XO) 所產(chǎn)生的超氧自由基：

1. 溶液A：將1 mg的BMPO溶解于1 ml的濃度為50 mM的PBS溶液 (pH 7.4)。
2. 溶液B：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有1 mMDTPA和0.4 mM黃嘌呤的混合溶液。
3. 溶液C：用50 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 配制含有0.1 U/ml的黃嘌呤氧化酶溶液。
4. 取15 μl溶液A，135 μl溶液B和10 μl溶液C混合。
5. 放置一段時間 (例如 8 min) 將溶液轉(zhuǎn)入EPR樣品管中檢測。
6. 通過峰值計算相對強(qiáng)度。

實驗案例

(*本數(shù)據(jù)僅供參考)

*本數(shù)據(jù)EPR儀器檢測得出，由于BMPO的分子結(jié)構(gòu)在平面上下差異較大，使得圖中BMPO/•OH的兩種異構(gòu)體的超精細(xì)結(jié)構(gòu)常數(shù)較大能夠被ESR分辨出來。本實驗中BMPO/•OH的兩種立體異構(gòu)體與BMPO/•OOH的構(gòu)成相似，兩種BMPO結(jié)合物的適宜條件為：

構(gòu)象異構(gòu)體 (conformer)Ⅰ：

a_N =13.47 G，aH
a_H^β=15.31 G，aH
a_H^γ1 = 0.62 G
構(gòu)象異構(gòu)體 (conformer)Ⅱ：
a_N =13.56 G，aH
a_H^β=12.3 G，aH
a_H^γ1 = 0.66 G

超氧化物檢測操作流程

1. 用100 mM的PBS溶液 (pH 7.4) 制備濃度為25 μM的DTPA，作為過渡金屬螯合劑。
2. 用100 mM PBS (pH 7.4)配制1 mM次黃嘌呤溶液。
3. 配制1 U/ml的黃嘌呤氧化酶溶液。
4. 將10 mg的BMPO溶于200 μl的PBS溶液中。(終濃度約為 250 mM)。
5. 向EP管中加入70 μl緩沖液。
6. 繼續(xù)添加20 μl濃度為250 mM的BMPO和100 μl步驟2中準(zhǔn)備的1 mM的次黃嘌呤溶液。
7. 加入10 μl黃嘌呤氧化酶觸發(fā)反應(yīng)，將EP管漩渦震蕩后轉(zhuǎn)移到扁平池。
8. 上樣并調(diào)整參數(shù)，獲得圖譜。

溶液終濃度為：25 mM BMPO， 0.5 mM次黃嘌呤和0.05 U/ml的黃嘌呤氧化酶。

羥自由基操作流程
1. 分別準(zhǔn)備1 mM的FeSO4，10 mM的H₂O₂和250 mM的BMPO水溶液。
2. 向EP管中加入140 μl的超純水。
3. 繼續(xù)加入20 μl濃度為250 mM的BMPO和20 μl濃度為1 mM的FeSO₄。
4. 加入20 μl濃度為10 mM的H₂O₂，觸發(fā)反應(yīng)。
5. 混合并迅速轉(zhuǎn)移至扁平池中。
6. 上樣并調(diào)整參數(shù)，獲得圖譜。
溶液終濃度為：25 mM BMPO，0.1 mM FeSO₄和1 mM H₂O₂
*建議實驗人員做背景圖片，以在EPR圖譜中排除自選雜質(zhì)的干擾。

相關(guān)參考數(shù)據(jù)

超氧化物信號強(qiáng)弱隨時間的變化曲線和半衰期時間

*BMPO檢測超氧陰離子O^2•-的半衰期 (pH=7.4) 更長。因此更適合長時間觀察樣品的實驗。(如檢測生物酶反應(yīng))