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Calcein-AM/PI細(xì)胞雙染試劑盒 熒光特性：
Calcein-AM : λex=490 nm , λem=515 nm
PI : λex=530 nm , λem=580 nm

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Calcein-AM/PI細(xì)胞雙染試劑盒 染色案例：

                                                                           細(xì)胞染色實(shí)例

         

              （a）                                     （b）                                      （c）

1. Calcein-AM染FTC細(xì)胞（活細(xì)胞單染）
2.  PI染HCT116細(xì)胞（死細(xì)胞單染）
3. Calcein-AM、PI染MHD-1 細(xì)胞（活死細(xì)胞雙染）

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Calcein-AM/PI 最適濃度:
由于不同細(xì)胞種類、細(xì)胞濃度的染色條件不同，我們建議自行摸索一下Calcein-AM和PI的最適濃度。
Calcein-AM和PI的最佳濃度是根據(jù)不同的細(xì)胞種類而定，通過(guò)以下的操作，我們可以找到不同細(xì)胞染色試劑的最佳濃度：
1. 通過(guò)在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黃皂苷中培養(yǎng)10 min或通過(guò)在70%乙醇中培養(yǎng)30 min制備死細(xì)胞。
2. 用0.1-10 μM PI溶液染死細(xì)胞，以便找到僅針對(duì)細(xì)胞核染色而不對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的PI濃度。
3. 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液染死細(xì)胞，以便找到不對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的Calcein-AM濃度，再以此濃度的Calcein-AM對(duì)活細(xì)胞染色以檢驗(yàn)活細(xì)胞是否被染色。

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Calcein-AM/PI細(xì)胞雙染試劑盒 實(shí)驗(yàn)步驟
以HeLa細(xì)胞為例
制備1 mmol/l的Calcein-AM儲(chǔ)存液
【500 次】
將200 μl DMSO加入到含200 μg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。
【3000 次】
將1 ml DMSO加入到含1 mg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。
※Calcein-AM儲(chǔ)存液需要避光，在-20℃密封保存。

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使用方法
1. 工作液的配制
1.1 1×Assay Buffer（反應(yīng)緩沖液）的配制
從低溫冰箱內(nèi)取出10×Assay Buffer，根據(jù)單次用量無(wú)菌條件取出適量，用去離子水（dH2O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。
注意：低溫情況可能有析出現(xiàn)象，可在室溫情況下?lián)u勻使用。
1.2 1×染色工作液的配制
1）先將低溫保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室溫20-30 min。
注意：第一次使用可對(duì)母液進(jìn)行分裝，以減少反復(fù)凍融次數(shù)。 注意：由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差，此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完。
2. 染色步驟
2.1  對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用細(xì)胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細(xì)胞，之后離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3 min）。
對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接離心（1000 rpm，3 min）收集細(xì)胞。
2.2  去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細(xì)胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。
2.3  用1×Assay Buffer制備細(xì)胞懸液，使其密度為1×105~1×106細(xì)胞/mL。
2.4  取100 µL染色工作液加入200 µL細(xì)胞懸液內(nèi)，混勻，37℃孵育15 min。
注意：如果需要，可延長(zhǎng)孵育時(shí)間至30min。
2.5  熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發(fā)濾片同時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞（黃綠色熒光）以及死細(xì)胞（紅色熒光）。另外，使用545 nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細(xì)胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進(jìn)行檢測(cè)。
注意：可以使用以下方法來(lái)優(yōu)化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度。
a）用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育細(xì)胞10 min，或者用70%乙醇孵育細(xì)胞30 min，從而制備死細(xì)胞；
b）用0.1-10 µM的PI溶液進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到僅僅對(duì)細(xì)胞核染色，而不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。
c）用0.1-10 µM的Calcein-AM進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進(jìn)行活細(xì)胞染色，去觀察是否活細(xì)胞能被染色。

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實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
1、 由于本試劑盒中的Calcein-AM Reagent 粉末和PI Stock Solution量很少，有可能會(huì)粘在蓋子或管壁上，開封前請(qǐng)先渦旋以使其振落下來(lái)。
2、 由于Calcein-AM儲(chǔ)存液對(duì)潮氣敏感，請(qǐng)?jiān)谑褂煤竺荛]Calcein-AM儲(chǔ)存液的蓋子。如果不能一次用完，建議分裝保存，例如分裝成10 μl/管，用封口膜封口，并用鋁箔紙包裹，放在一個(gè)密閉性能好的塑料袋中，并放入一包干燥劑，在≤-20℃密封避光保存。
3、 配制好的染色工作液請(qǐng)?jiān)诋?dāng)天使用。
4、 PI有疑似致癌性，使用前應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
a.使用時(shí)請(qǐng)帶好手套，口罩，防護(hù)眼鏡等，不要接觸到或呼吸到。
b.當(dāng)PI不慎接觸到皮膚時(shí)，請(qǐng)立刻用大量的水沖洗。
c.處理方法
清洗容器的清洗液和廢液請(qǐng)按照實(shí)驗(yàn)室的有毒有害物質(zhì)的處理方法進(jìn)行處理，或按照以下方法處理：
用UV照射的方法進(jìn)行分解
用次氯酸鈉氧化分解后，進(jìn)行中和處理

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