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熒光染料（Fluorescent dyes）
Release Time：2022-08-20熒光染料的定義：
熒光染料（也稱(chēng)為熒光團(tuán)/活性染料）可以簡(jiǎn)單地描述為分子（本質(zhì)上是非蛋白質(zhì)），在顯微鏡下，通過(guò)吸收給定波長(zhǎng)的光并以更長(zhǎng)的波長(zhǎng)重新發(fā)射光來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能。 這種熒光產(chǎn)生不同的顏色，可以可視化和分析。
熒光染料通常用于各種生物分子（抗體、肽、各種蛋白質(zhì)等）的熒光標(biāo)記，用于監(jiān)測(cè)藥物向目標(biāo)組織的輸送、成像等過(guò)程。
熒光染料分類(lèi)：
※ 有機(jī)熒光染料
※ 生物熒光基團(tuán)
一、有機(jī)熒光染料
本質(zhì)上，有機(jī)染料的特征在于源自在整個(gè)生色團(tuán)上離域的光學(xué)躍遷或源自分子間電荷轉(zhuǎn)移躍遷（從激發(fā)電子態(tài)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移）的發(fā)射。
在這里，表現(xiàn)出源自在整個(gè)生色團(tuán)上離域的光學(xué)躍遷的發(fā)射的染料被稱(chēng)為共振染料（介觀染料），而后者被稱(chēng)為 CT 染料（電荷轉(zhuǎn)移染料）?；ㄇ唷⒘_丹明和熒光素是一些最常見(jiàn)的共振染料，其特點(diǎn)是窄的吸收和發(fā)射帶（略微結(jié)構(gòu)化），往往相互鏡像，以及小的、對(duì)溶劑極性不敏感的斯托克斯位移。
另一方面，CT 染料包括香豆素和丹磺酰熒光團(tuán)等染料，其特點(diǎn)是與共振染料相比，吸收和發(fā)射帶結(jié)構(gòu)無(wú)結(jié)構(gòu)，分離良好，以及更大的斯托克斯位移。
同樣，與共振染料相比，CT 染料具有更小的摩爾吸收系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。
※ 對(duì)于共振和 CT 熒光染料，在結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系眾所周知的情況下，可以通過(guò)精心設(shè)計(jì)的策略來(lái)微調(diào)光譜性質(zhì)。
1.有機(jī)熒光染料的種類(lèi):
a. 熒光素
與花青和羅丹明染料一樣，熒光素也是一種有機(jī)染料。 熒光素 的最大吸收波長(zhǎng)為 494nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 521nm（通常吸收藍(lán)色范圍內(nèi)的光并發(fā)射綠色范圍內(nèi)的光），熒光素是一種高熒光物質(zhì)。 即使在非常少量的情況下也可以檢測(cè)到它，并且在與抗體結(jié)合時(shí)用于顯微鏡檢查。
熒光素的衍生物包括異硫氰酸熒光素、俄勒岡綠和羧基萘并熒光素等。 與許多其他熒光染料一樣，熒光素價(jià)格低廉且易于使用，使其成為生物學(xué)研究中最受歡迎的染料之一。
與大多數(shù)其他染料不同，熒光素在水溶液中是無(wú)毒的。 因此，它是極少數(shù)用作地下水示蹤劑的染料之一。
b. 異硫氰酸熒光素 (FITC)
異硫氰酸熒光素是流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光中最常用的有機(jī)熒光染料/探針之一。 它的特點(diǎn)是最大/峰值吸光度為 495nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 520nm，熒光素與熒光素之間的相互作用導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移和濃縮時(shí)的自猝滅。
異硫氰酸熒光素染料標(biāo)記分子應(yīng)用：
(a)電泳分離后的蛋白質(zhì)檢測(cè)
(b)蛋白質(zhì)和肽的微測(cè)序分析
(c)使用毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)行分子分析
(d)生物相互作用中的分子跟蹤和檢測(cè)
(e)細(xì)胞和組織切片中的抗原檢測(cè)
(f)通過(guò)標(biāo)記 DNA 片段進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)
除了因其在水中的溶解性而易于用于偶聯(lián)物制備外，異硫氰酸熒光素還具有明亮的熒光（由于偶聯(lián)后的大消光系數(shù)和高量子產(chǎn)率），使其成為許多工藝的首選染料。
※ 在流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光顯微術(shù)中，染料與各種抗體（一抗或二抗）結(jié)合，以檢查和研究IL-17免疫缺陷和CD63在腎功能中的作用等狀態(tài)。
※ 作為熒光素的衍生物，異硫氰酸熒光素含有一個(gè)異硫氰酸酯反應(yīng)基團(tuán)，這有助于其對(duì)通常存在于生物分子中的動(dòng)漫和巰基基團(tuán)具有反應(yīng)性。
※ 流式細(xì)胞術(shù)簡(jiǎn)介
免疫熒光顯微術(shù)涉及在顯微鏡下觀察化學(xué)標(biāo)記的分子，而流式細(xì)胞術(shù)涉及在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)和測(cè)量此類(lèi)分子的特征。
在流式細(xì)胞術(shù)方法中，來(lái)自給定培養(yǎng)物/組織樣品的細(xì)胞懸液（單細(xì)胞懸液）在微量滴定器中與熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體一起孵育，然后在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行分析。
在流式細(xì)胞儀中，使用鞘液聚焦懸浮液，使其細(xì)胞一次一個(gè)地通過(guò)激光束。 然后檢測(cè)發(fā)射的光（來(lái)自標(biāo)記細(xì)胞的熒光）用于分析。
c. 花青熒光染料
花青類(lèi)熒光染料屬于共振染料，其特征在于具有離域電荷的氮原子（兩個(gè)氮原子）之間的聚甲炔染料。 由于與生物分子的低非特異性結(jié)合以及明亮的熒光，花青類(lèi)熒光染料已成為一些最流行的用于標(biāo)記核酸的熒光染料。
花青類(lèi)染料分為兩大類(lèi)：
※ 非磺化花青類(lèi)染料 - 該組中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。 在大多數(shù)情況下，這些染料的特點(diǎn)是水溶性低，但胺的鹽酸鹽和酰肼除外。
它們首先溶解在有機(jī)溶劑（共溶劑）中，然后在生物分子標(biāo)記期間添加到含有生物分子的溶液中。
而“Cy”代表花青，第一個(gè)數(shù)字代表存在于亞油啉基團(tuán)之間的碳原子數(shù)。 另一方面，添加 0.5 后綴以表示苯并稠合花青。 這些熒光染料通常用于有機(jī)介質(zhì)。
※ 磺化類(lèi)花青染料 - 該組由磺基-Cy3、磺基-Cy5 和磺基-Cy7 組成。 顧名思義，這些花青的特征是一個(gè)磺基，它有助于染料分子在水相中的溶解。
與非磺化花青相比，這些花青更易溶于水，因此不需要溶解在有機(jī)溶劑中進(jìn)行標(biāo)記。 磺化花青通常用于標(biāo)記疏水性蛋白質(zhì)、水溶液中的納米顆粒以及可能被 DMSO 或 DMF 變性的敏感蛋白質(zhì)。
※ 兩組染料均可用于標(biāo)記以下生物分子：
肽、寡核苷酸和 DNA、抗體、可溶性蛋白質(zhì)。
d.羅丹明熒光染料
與 曙紅(Eosin) 和 熒光素一起，羅丹明屬于呫噸族。 與市場(chǎng)上的許多其他染料相比，羅丹明具有出色的光穩(wěn)定性以及許多光物理特性，使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。
它們?cè)诰酆衔锛{米粒子表面的表征、聚合物-生物偶聯(lián)物的檢測(cè)、活細(xì)胞的成像以及寡核苷酸在膠乳上的吸附分析等方面特別有用。
羅丹明熒光染料的衍生物也用作：
分子開(kāi)關(guān)，病毒表面修飾，化學(xué)傳感器，硫醇。
不同類(lèi)型的染料通過(guò)它們各自的取代基（R1、R2、R3、R4 和 G）來(lái)區(qū)分。 由于它們的差異，這些熒光染料在溶液中也表現(xiàn)出不同的光物理特性（例如不同的熒光壽命和發(fā)射最大值）。
氨基被剛性化的羅丹明染料無(wú)論溫度范圍如何都表現(xiàn)出高量子產(chǎn)率，而在每個(gè)氮處具有兩個(gè)烷基取代基的那些表現(xiàn)出活化的內(nèi)部轉(zhuǎn)化，量子產(chǎn)率和熒光壽命隨溫度的變化而變化。
※ 羅丹明 101 和羅丹明 B 是一些最常用的羅丹明染料，具有以下特點(diǎn)：
--羧基傾向于在酸性溶液中質(zhì)子化
--染料轉(zhuǎn)化為兩性離子堿性溶液
--兩性離子染料在極性較小的有機(jī)溶劑中變?yōu)闊o(wú)色內(nèi)酯
* 要將羅丹明用作熒光探針，必須對(duì)其進(jìn)行修改。 這可以通過(guò)(the xanthene moiety)氨基、羧基苯基環(huán)或羧酸基團(tuán)的修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。
* 與 TRITC 一樣，羅丹明 (NHS-rhodamine) 的 熒光特性為 544nm（最大吸收波長(zhǎng)）和 576nm（最大發(fā)射）。
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二、生物熒光基團(tuán)
在 1990 年代首次使用的綠色熒光蛋白（從水母維多利亞水母克?。┘捌溲苌铮ɡ缭寮t藍(lán)蛋白、藻膽蛋白和藻紅蛋白等）是當(dāng)今生物學(xué)研究中最常用的一些生物熒光團(tuán)。
雖然熒光團(tuán)可用于在細(xì)胞、細(xì)菌和各種器官中表達(dá)質(zhì)粒，但它們的使用有一些缺點(diǎn)，即它可能很耗時(shí)，并且在融合時(shí)還能夠改變某些細(xì)胞蛋白的正常生物學(xué)功能。
此外，與許多其他熒光團(tuán)相比，生物熒光團(tuán)的光穩(wěn)定性和靈敏度較低。
1. 綠色熒光蛋白 (GFP)
綠色熒光蛋白是最流行的生物熒光團(tuán)之一，由 238 個(gè)氨基酸組成，其中三個(gè)負(fù)責(zé)發(fā)出可見(jiàn)綠色熒光的結(jié)構(gòu)。 在水母本身中，熒光團(tuán)與水母發(fā)光蛋白（一種蛋白質(zhì)）相互作用，當(dāng)添加鈣時(shí)會(huì)發(fā)出藍(lán)光。
通過(guò) DNA 重組，研究人員可以使用負(fù)責(zé)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因來(lái)研究給定的基因和蛋白質(zhì)。 在這里，在將復(fù)合物插入細(xì)胞之前，該基因與另一個(gè)基因（負(fù)責(zé)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的第二個(gè)基因）結(jié)合。
如果細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光，研究人員就可以明顯看出該細(xì)胞能夠表達(dá)目標(biāo)基因。
* GFP 由 488nm 激光線激發(fā)，可在 510nm 處檢測(cè)。
* 來(lái)自熒光團(tuán)的微弱信號(hào)可以使用抗 GFP 抗體放大。
作為生物標(biāo)記物，綠色熒光蛋白用于以下功能：
* 監(jiān)測(cè)各種生理過(guò)程
* 識(shí)別蛋白質(zhì)定位
* 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)
2. 生物熒光團(tuán)包括：
※ 藻紅蛋白 - 藻紅蛋白 (PE) 是一種紅色蛋白色素復(fù)合物，屬于藻膽蛋白家族。 它可以在紅藻和隱植物中找到，它作為葉綠素色素的附屬物。
在生物科學(xué)中，熒光團(tuán)可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，例如用于抗原檢測(cè)的抗體等，因?yàn)樗軌虬l(fā)出明亮的熒光。 由于熒光團(tuán)往往會(huì)很快發(fā)生光漂白，因此很少在熒光顯微鏡中使用。 它經(jīng)常用于流式細(xì)胞術(shù)。
※ 別藻藍(lán)蛋白 (APC) - 與藻紅蛋白一樣，別藻藍(lán)蛋白也屬于藻膽蛋白家族，是從紅藻中分離出來(lái)的。 在 594 和 633 nm 的激光線激發(fā)下，熒光團(tuán)的最大吸光度在 650 nm 處，而熒光發(fā)射峰在 66 nm 處。
與熒光素偶聯(lián)物相比，熒光團(tuán)的靈敏度已顯示高 5 至 10 倍，并具有許多其他有益特性，包括大斯托克斯位移、高水溶性、長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射和耐猝滅。
雖然別藻藍(lán)蛋白通常不用于需要光穩(wěn)定性的應(yīng)用，但它廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、微陣列等過(guò)程以及各種依賴(lài)高靈敏度的應(yīng)用。
3. 量子點(diǎn)
量子點(diǎn)開(kāi)發(fā)于 1980 年代，是尺寸范圍在 2 到 50nm 之間的納米晶體（無(wú)機(jī)納米晶體）。根據(jù)大小，發(fā)出的光會(huì)從藍(lán)色變?yōu)榧t色（小的 QT 呈現(xiàn)藍(lán)光，而較大的 QT 呈現(xiàn)紅光）。
與當(dāng)今使用的其他一些熒光團(tuán)相比，量子點(diǎn)具有很大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)控制粒徑、表面化學(xué)、分布以及組成材料來(lái)控制/調(diào)節(jié)它們的光學(xué)特性。
因此，它們適用于免疫標(biāo)記、多重生物檢測(cè)以及體外和體內(nèi)分析的分子成像等過(guò)程。
探針的主要特征之一是由于量子尺度效應(yīng)，它們具有寬的激發(fā)波長(zhǎng)范圍以及窄的發(fā)射范圍。
通過(guò)利用這一特殊特性，可以在同一光源下激發(fā)多色量子點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣本中多個(gè)目標(biāo)的多路檢測(cè)和觀察。
a.量子點(diǎn)與其他熒光團(tuán)不同的一些有益特性包括：
* 表現(xiàn)出 40% 至 90% 的高量子產(chǎn)率
* 非常高的熒光強(qiáng)度 - 這比羅丹明 6G11 分子亮約 20 倍
* 高度抗光漂白
* 探頭尺寸越大，發(fā)射波長(zhǎng)越長(zhǎng)
注意：量子點(diǎn)的主要缺點(diǎn)之一是發(fā)光間歇性（閃爍），這可能會(huì)影響分子檢測(cè)的某些過(guò)程。
為了將生物分子連接到量子點(diǎn)（生物共軛），使用了以下策略：
* 電子相互作用——使用表面活性劑（如巰基乙酸）來(lái)修飾量子點(diǎn)表面并提高溶解度。
* 共價(jià)連接 - 涉及使用諸如將分子的官能團(tuán)（例如羧基和氨基官能團(tuán)）連接到量子點(diǎn)表面的策略。
* 作為介質(zhì)的功能化微珠——可能涉及將量子點(diǎn)封裝到聚合物微珠中，這使得它們表面的官能團(tuán)能夠與生物分子結(jié)合。
* 碳基量子點(diǎn)（例如石墨烯量子點(diǎn)）是新一代探針。 除了保留傳統(tǒng)量子點(diǎn)的許多優(yōu)點(diǎn)外，它們還被證明在生物共軛過(guò)程中表現(xiàn)出更有益的特性，而且細(xì)胞毒性很小。
4. 納米粒子
納米顆粒是指尺寸在 1 到 100 納米之間的顆粒。由于它們的小尺寸，納米粒子通常用于不同類(lèi)型的細(xì)胞和組織的熒光成像。
當(dāng)今生物成像中常用的一些納米材料包括碳點(diǎn)、貴金屬納米顆粒、聚合物點(diǎn)、量子點(diǎn)和熒光摻雜二氧化硅等。
在成像中，與其他分子熒光團(tuán)和探針相比，納米顆粒/納米材料具有多種優(yōu)勢(shì)，使其成為理想的選擇。除了提高亮度外，納米粒子是惰性的并且往往分布均勻，這有助于在成像過(guò)程中獲得更好的結(jié)果。
此外，與各種分子熒光團(tuán)相比，納米顆粒和納米材料沒(méi)有細(xì)胞毒性，并且不受非特異性結(jié)合問(wèn)題的影響。由于這些特性，大多數(shù)熒光納米顆粒（染色納米顆粒）可以?xún)?nèi)化到細(xì)胞/組織中，并容易靶向給定部位。
