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DNA和RNA純化方法
Release Time：2022-09-20DNA和RNA純化方法:您是否正在建立一個新實驗室并想知道您需要什么來純化 DNA 和 RNA？ 或者您是否發(fā)現(xiàn)您的樣品對于您的下游應(yīng)用來說不夠純凈？
與核酸提取相比，DNA 和 RNA 純化不包括任何破壞細胞膜和釋放核酸的裂解步驟。 相反，它涉及您的樣品的清理，例如 有效去除所有在 PCR 過程中用于促進目標(biāo)序列擴增的成分。
1. 乙醇和異丙醇沉淀
我們將仔細研究的第一種純化方法是乙醇和異丙醇沉淀。這是純化基因組 DNA 的首選方法，可用于在 CsCl 密度梯度離心與 EthBr、苯酚-氯仿提取、消化和 PCR 等應(yīng)用后濃縮和脫鹽核酸樣品。
1.1 它的工作原理？
乙醇和異丙醇沉淀都與溶解度有關(guān)。水和核酸都是極性分子，這就是DNA和RNA容易溶于水的原因。要沉淀它們，您可以使用乙醇或異丙醇。
對于乙醇沉淀，您需要向溶液中加入兩倍體積的冰冷的 96% 乙醇和鹽（通常是乙酸鈉）。乙醇降低介電常數(shù)，使糖磷酸骨架上的負(fù)電荷被乙酸鈉的 Na+ 離子中和。由于核酸現(xiàn)在的親水性降低，當(dāng)您在冰上孵育混合物時，它們會從溶液中脫落。然后離心您的樣品以將核酸與其他核酸分離，并在冷的 70% 乙醇中清洗沉淀以去除任何殘留的鹽分。再次離心樣品，去除乙醇，讓核酸沉淀干燥，然后將其重新懸浮在干凈的水性緩沖液中。
要干燥核酸沉淀，您可以將試管（打開蓋子）放在層流罩幾個小時，或使用真空離心機。您選擇的方法取決于您，但您必須確保顆粒完全干燥，以避免殘留的乙醇對您的下游應(yīng)用產(chǎn)生負(fù)面影響。
異丙醇沉淀非常相似。唯一的區(qū)別是您可以跳過冰上孵育步驟，并在第一步中用室溫異丙醇代替冰冷的乙醇。關(guān)于異丙醇的體積，等于樣品體積的量就足夠了。
乙醇還是異丙醇更合適取決于您的樣品體積、濃度和核酸片段的大小。如果您有大量樣品，可能無法將兩倍樣品體積的乙醇加入試管中。異丙醇沉淀對于較大核酸片段和較低樣品濃度的沉淀也是優(yōu)選的，因為核酸在異丙醇中的溶解度較低。最重要的是，異丙醇沉淀是更快的方法，因為您不需要在離心前孵育您的樣品。
1.2 優(yōu)缺點
乙醇和異丙醇沉淀根本不昂貴，因為乙醇、異丙醇和乙酸鈉非常便宜，并且該過程提供了高純度核酸的良好收率。然而，這是一個非常耗時的過程，并且由于需要手動執(zhí)行，因此變化很大。因此，低再現(xiàn)性可能是一個問題。
1.3 所需設(shè)備
乙醇或異丙醇沉淀所需的只是離心機和層流罩，或真空離心機來干燥顆粒。
2. 凝膠電泳和離心柱純化
由于凝膠電泳根據(jù)核酸長度分離核酸，因此您可以使用此方法將感興趣的核酸與其他核酸類型和污染物分離。
2.1 它是如何工作的？
首先，您需要運行凝膠。有關(guān)如何進行瓊脂糖凝膠電泳的更多詳細信息，請參閱我們關(guān)于核酸定量和可視化的文章的第 1 節(jié)。
可視化凝膠后，使用鋒利的手術(shù)刀切除感興趣的核酸條帶。 在此步驟中，請始終記住佩戴適當(dāng)?shù)?PPE（面罩和手套），尤其是在使用紫外線來顯示您的樂隊時。 然后，使用合適的離心柱純化試劑盒從 TAE 或 TBE 緩沖瓊脂糖凝膠中純化核酸條帶。 由于可用的各種套件彼此略有不同，因此您應(yīng)仔細遵循制造商的說明。 通常，您需要稱量核酸條帶的重量，每 100 mg 凝膠切片添加指定量的緩沖液，然后加熱混合物以溶解瓊脂糖。然后將樣品轉(zhuǎn)移到離心柱并純化核酸 酸使用結(jié)合、洗滌和洗脫步驟。 有關(guān)離心柱協(xié)議如何工作的更多詳細信息，請參閱我們關(guān)于核酸提取的文章的第 2.2.2.1 節(jié)。
2.2 優(yōu)缺點
這種核酸純化方法的巨大優(yōu)勢在于瓊脂糖不會使核酸變性，因此很容易從凝膠中回收它們而不會造成任何傷害。但是，它不適合高通量實驗室，因為運行凝膠非常耗時，并且僅限于少量樣品。
2.3 所需設(shè)備
與其他純化方法相比，此工作流程需要許多不同的儀器。瓊脂糖凝膠電泳需要凝膠電泳系統(tǒng)、外部電源和生物安全柜，因為您將使用危險的嵌入染料。離心柱純化要求不高，因為您只需要一臺離心機。
3. 離心柱純化
離心柱不僅用于從裂解樣品中提取核酸，還用于純化它們，例如在 PCR 反應(yīng)后去除可能抑制后續(xù)應(yīng)用的鹽、酶、引物、引物二聚體和核苷酸。
3.1 它是如何工作的？
如上所述，離心柱純化方案包括結(jié)合、洗滌和洗脫步驟。將樣品轉(zhuǎn)移到離心柱中后，將它們離心以將核酸結(jié)合到柱內(nèi)的膜上。這允許不需要的組件通過。使用洗滌緩沖液的幾個額外的離心步驟去除殘留的不需要的材料，使用洗脫緩沖液的最后離心步驟將核酸從膜中釋放出來。
3.2 優(yōu)缺點
如您所見，這種純化方法既快速又簡單。最重要的是，它可以適應(yīng)您的樣品數(shù)量，因為您也可以使用 96 孔硅膠膜板代替單離心柱。但是，膜可能會堵塞，并且由于需要 30-50 μl 的最小洗脫體積，因此您可能會得到相當(dāng)?shù)偷暮怂釢舛取?br /> 3.3 所需設(shè)備
離心柱純化所需的唯一設(shè)備是離心機，除非您使用 96 孔格式并更喜歡使用帶泵的真空歧管，這也是可能的。
4. 磁珠純化
就像離心柱一樣，磁珠既可用于從裂解樣品中提取核酸，也可用于純化。例如，您可以使用磁珠從 PCR 產(chǎn)物中去除鹽、酶、引物、引物二聚體和核苷酸，否則會抑制后續(xù)應(yīng)用。
4.1 它是如何工作的？
使用磁珠的純化工作流程與提取工作流程非常相似。您首先添加將核酸結(jié)合到樣品上的磁珠。
然后將試管放在磁鐵上，去除含有不需要的未結(jié)合物質(zhì)的上清液。您重復(fù)此步驟幾次，在其間更換洗滌緩沖液。最后，您添加洗脫緩沖液并將樣品轉(zhuǎn)移到不同的容器中。
與使用磁珠的提取方案相比，在純化過程中只有特定長度的核酸片段與磁珠結(jié)合。這種尺寸排阻機制是通過為感興趣的核酸片段創(chuàng)造完美的結(jié)合條件，通過改變緩沖液、鹽和它們的濃度以及因此的親水性/疏水性來實現(xiàn)的。
4.2 優(yōu)缺點
磁珠純化的一個巨大優(yōu)勢是可以根據(jù)您的預(yù)算選擇所需的設(shè)備。
選項 1：獲取磁性支架并手動執(zhí)行工作流程。這是最便宜的選擇，但也是最乏味和最容易出錯的方法。您需要非常小心不要吸入珠子，因為這會導(dǎo)致樣品損失。
選項 2：對于高通量應(yīng)用，您還可以購買臺式移液機器人，或 96 或 384 通道移液器。這些設(shè)備減少了手動液體處理步驟，提高了生產(chǎn)率和可重復(fù)性，也可用于其他應(yīng)用。有關(guān)如何將此類設(shè)備用于磁珠純化的更多信息，請訪問我們關(guān)于使用 MACHEREY-NAGEL 的 NucleoSpin® 96 質(zhì)粒試劑盒進行質(zhì)粒 DNA 純化、使用 Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 ASSIST PLUS 進行 PCR 純化以及使用Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 VIAFLO 96。
選項 3：通過購買專用純化系統(tǒng)自動化整個工作流程。
磁珠純化的另一個方便之處在于，您可以使用比旋轉(zhuǎn)柱純化更低的洗脫體積，而且它更易于擴展，因為您可以將它與 384 孔板一起使用。
4.3 所需設(shè)備
如前所述，您可以將磁珠純化設(shè)備與您的預(yù)算相匹配。如果預(yù)算有限，可以購買磁性支架，如果有更多資金，可以購買臺式移液機器人或 96 或 384 通道移液器，或者使用專用的純化系統(tǒng)。
5.Sephadex® 純化
Sephadex 純化可用于從較小的分子中純化核酸，例如引物、核苷酸或染料。
5.1 它是如何工作的？
Sephadex 是一種凝膠過濾樹脂，由環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)的葡聚糖制成。5 要制備樹脂，您需要將 Sephadex 粉末添加到離心柱中，用水再水合，然后離心柱以去除多余的水。在第二次旋轉(zhuǎn)色譜柱之前，將樣品添加到樹脂頂部。在離心過程中，較大的分子很容易通過樹脂并洗脫，而較小的分子會被困在葡聚糖珠的孔隙中。微珠的尺寸排除能力取決于您選擇的 Sephadex 類型。例如，Sephadex G-25 Medium5可用于純化分子量>5000的核酸，G-50 Medium6適用于分子量>30000的分子。
為了加快這一工作流程，請選擇預(yù)裝 Sephadex 的離心柱，而不是自己創(chuàng)建它們，或者在 96 孔過濾板中工作。
5.2 優(yōu)缺點
就像離心柱純化一樣，該方法可以根據(jù)您的通量需求進行調(diào)整，方法是在離心柱或 96 孔濾板中進行。不存在分子-基質(zhì)結(jié)合步驟還可以防止對核酸造成不必要的損傷，7 使其成為一種相當(dāng)溫和的純化方法。然而，這非常耗時，尤其是在您自己準(zhǔn)備離心柱或過濾板時——Sephadex 必須再水合大約三個小時——而且不能自動化。
5.3 所需設(shè)備
Sephadex 純化所需的唯一設(shè)備是離心機。
6. 酶促方法
如果您的后續(xù)應(yīng)用，一些制造商會提供酶法來清理您的 PCR 產(chǎn)物——例如Sanger 測序、下一代測序或 SNP 分析——要求您的樣品不含未摻入的引物和 dNTP。
6.1 它是如何工作的？
酶促方法僅包括兩個步驟。首先，將酶混合物添加到樣品中，并在 37 °C 下孵育 15 分鐘。在孵育過程中，混合物中的第一種酶，核酸外切酶 I，將消化多余的引物，第二種酶，堿性磷酸酶，將去磷酸化 PCR 期間未消耗的 dNTP。酶發(fā)揮作用后，您可以將樣品加熱到 80 °C 再加熱 15 分鐘以使酶失活。
6.2 優(yōu)缺點
除了快速簡便之外，此方法不會導(dǎo)致樣品損失，并且可以輕松適應(yīng)您的樣品數(shù)量。它唯一的缺點是它只能用于從引物和 dNTPs 中清除 PCR 產(chǎn)物，而不能去除任何其他 cont
7. 結(jié)論
如您所見，每種樣品類型、下游應(yīng)用和預(yù)算都有一種核酸純化方法。 我們希望本文能幫助您確定選擇哪一個來滿足您的特定需求。
如果您來這里不僅是為了了解核酸純化的技巧，您可能還想了解收集樣本、提取核酸、執(zhí)行 PCR 反應(yīng)和量化核酸所需的知識。 當(dāng)我們正在裝備一個新的內(nèi)部實驗室時，我們整理了這個由五部分組成的系列，現(xiàn)在看起來像這樣：
與核酸提取相比，DNA 和 RNA 純化不包括任何破壞細胞膜和釋放核酸的裂解步驟。 相反，它涉及您的樣品的清理，例如 有效去除所有在 PCR 過程中用于促進目標(biāo)序列擴增的成分。
1. 乙醇和異丙醇沉淀
我們將仔細研究的第一種純化方法是乙醇和異丙醇沉淀。這是純化基因組 DNA 的首選方法，可用于在 CsCl 密度梯度離心與 EthBr、苯酚-氯仿提取、消化和 PCR 等應(yīng)用后濃縮和脫鹽核酸樣品。
1.1 它的工作原理？
乙醇和異丙醇沉淀都與溶解度有關(guān)。水和核酸都是極性分子，這就是DNA和RNA容易溶于水的原因。要沉淀它們，您可以使用乙醇或異丙醇。
對于乙醇沉淀，您需要向溶液中加入兩倍體積的冰冷的 96% 乙醇和鹽（通常是乙酸鈉）。乙醇降低介電常數(shù)，使糖磷酸骨架上的負(fù)電荷被乙酸鈉的 Na+ 離子中和。由于核酸現(xiàn)在的親水性降低，當(dāng)您在冰上孵育混合物時，它們會從溶液中脫落。然后離心您的樣品以將核酸與其他核酸分離，并在冷的 70% 乙醇中清洗沉淀以去除任何殘留的鹽分。再次離心樣品，去除乙醇，讓核酸沉淀干燥，然后將其重新懸浮在干凈的水性緩沖液中。
要干燥核酸沉淀，您可以將試管（打開蓋子）放在層流罩幾個小時，或使用真空離心機。您選擇的方法取決于您，但您必須確保顆粒完全干燥，以避免殘留的乙醇對您的下游應(yīng)用產(chǎn)生負(fù)面影響。
異丙醇沉淀非常相似。唯一的區(qū)別是您可以跳過冰上孵育步驟，并在第一步中用室溫異丙醇代替冰冷的乙醇。關(guān)于異丙醇的體積，等于樣品體積的量就足夠了。
乙醇還是異丙醇更合適取決于您的樣品體積、濃度和核酸片段的大小。如果您有大量樣品，可能無法將兩倍樣品體積的乙醇加入試管中。異丙醇沉淀對于較大核酸片段和較低樣品濃度的沉淀也是優(yōu)選的，因為核酸在異丙醇中的溶解度較低。最重要的是，異丙醇沉淀是更快的方法，因為您不需要在離心前孵育您的樣品。
1.2 優(yōu)缺點
乙醇和異丙醇沉淀根本不昂貴，因為乙醇、異丙醇和乙酸鈉非常便宜，并且該過程提供了高純度核酸的良好收率。然而，這是一個非常耗時的過程，并且由于需要手動執(zhí)行，因此變化很大。因此，低再現(xiàn)性可能是一個問題。
1.3 所需設(shè)備
乙醇或異丙醇沉淀所需的只是離心機和層流罩，或真空離心機來干燥顆粒。
2. 凝膠電泳和離心柱純化
由于凝膠電泳根據(jù)核酸長度分離核酸，因此您可以使用此方法將感興趣的核酸與其他核酸類型和污染物分離。
2.1 它是如何工作的？
首先，您需要運行凝膠。有關(guān)如何進行瓊脂糖凝膠電泳的更多詳細信息，請參閱我們關(guān)于核酸定量和可視化的文章的第 1 節(jié)。
可視化凝膠后，使用鋒利的手術(shù)刀切除感興趣的核酸條帶。 在此步驟中，請始終記住佩戴適當(dāng)?shù)?PPE（面罩和手套），尤其是在使用紫外線來顯示您的樂隊時。 然后，使用合適的離心柱純化試劑盒從 TAE 或 TBE 緩沖瓊脂糖凝膠中純化核酸條帶。 由于可用的各種套件彼此略有不同，因此您應(yīng)仔細遵循制造商的說明。 通常，您需要稱量核酸條帶的重量，每 100 mg 凝膠切片添加指定量的緩沖液，然后加熱混合物以溶解瓊脂糖。然后將樣品轉(zhuǎn)移到離心柱并純化核酸 酸使用結(jié)合、洗滌和洗脫步驟。 有關(guān)離心柱協(xié)議如何工作的更多詳細信息，請參閱我們關(guān)于核酸提取的文章的第 2.2.2.1 節(jié)。
2.2 優(yōu)缺點
這種核酸純化方法的巨大優(yōu)勢在于瓊脂糖不會使核酸變性，因此很容易從凝膠中回收它們而不會造成任何傷害。但是，它不適合高通量實驗室，因為運行凝膠非常耗時，并且僅限于少量樣品。
2.3 所需設(shè)備
與其他純化方法相比，此工作流程需要許多不同的儀器。瓊脂糖凝膠電泳需要凝膠電泳系統(tǒng)、外部電源和生物安全柜，因為您將使用危險的嵌入染料。離心柱純化要求不高，因為您只需要一臺離心機。
3. 離心柱純化
離心柱不僅用于從裂解樣品中提取核酸，還用于純化它們，例如在 PCR 反應(yīng)后去除可能抑制后續(xù)應(yīng)用的鹽、酶、引物、引物二聚體和核苷酸。
3.1 它是如何工作的？
如上所述，離心柱純化方案包括結(jié)合、洗滌和洗脫步驟。將樣品轉(zhuǎn)移到離心柱中后，將它們離心以將核酸結(jié)合到柱內(nèi)的膜上。這允許不需要的組件通過。使用洗滌緩沖液的幾個額外的離心步驟去除殘留的不需要的材料，使用洗脫緩沖液的最后離心步驟將核酸從膜中釋放出來。
3.2 優(yōu)缺點
如您所見，這種純化方法既快速又簡單。最重要的是，它可以適應(yīng)您的樣品數(shù)量，因為您也可以使用 96 孔硅膠膜板代替單離心柱。但是，膜可能會堵塞，并且由于需要 30-50 μl 的最小洗脫體積，因此您可能會得到相當(dāng)?shù)偷暮怂釢舛取?br /> 3.3 所需設(shè)備
離心柱純化所需的唯一設(shè)備是離心機，除非您使用 96 孔格式并更喜歡使用帶泵的真空歧管，這也是可能的。
4. 磁珠純化
就像離心柱一樣，磁珠既可用于從裂解樣品中提取核酸，也可用于純化。例如，您可以使用磁珠從 PCR 產(chǎn)物中去除鹽、酶、引物、引物二聚體和核苷酸，否則會抑制后續(xù)應(yīng)用。
4.1 它是如何工作的？
使用磁珠的純化工作流程與提取工作流程非常相似。您首先添加將核酸結(jié)合到樣品上的磁珠。
然后將試管放在磁鐵上，去除含有不需要的未結(jié)合物質(zhì)的上清液。您重復(fù)此步驟幾次，在其間更換洗滌緩沖液。最后，您添加洗脫緩沖液并將樣品轉(zhuǎn)移到不同的容器中。
與使用磁珠的提取方案相比，在純化過程中只有特定長度的核酸片段與磁珠結(jié)合。這種尺寸排阻機制是通過為感興趣的核酸片段創(chuàng)造完美的結(jié)合條件，通過改變緩沖液、鹽和它們的濃度以及因此的親水性/疏水性來實現(xiàn)的。
4.2 優(yōu)缺點
磁珠純化的一個巨大優(yōu)勢是可以根據(jù)您的預(yù)算選擇所需的設(shè)備。
選項 1：獲取磁性支架并手動執(zhí)行工作流程。這是最便宜的選擇，但也是最乏味和最容易出錯的方法。您需要非常小心不要吸入珠子，因為這會導(dǎo)致樣品損失。
選項 2：對于高通量應(yīng)用，您還可以購買臺式移液機器人，或 96 或 384 通道移液器。這些設(shè)備減少了手動液體處理步驟，提高了生產(chǎn)率和可重復(fù)性，也可用于其他應(yīng)用。有關(guān)如何將此類設(shè)備用于磁珠純化的更多信息，請訪問我們關(guān)于使用 MACHEREY-NAGEL 的 NucleoSpin® 96 質(zhì)粒試劑盒進行質(zhì)粒 DNA 純化、使用 Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 ASSIST PLUS 進行 PCR 純化以及使用Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 VIAFLO 96。
選項 3：通過購買專用純化系統(tǒng)自動化整個工作流程。
磁珠純化的另一個方便之處在于，您可以使用比旋轉(zhuǎn)柱純化更低的洗脫體積，而且它更易于擴展，因為您可以將它與 384 孔板一起使用。
4.3 所需設(shè)備
如前所述，您可以將磁珠純化設(shè)備與您的預(yù)算相匹配。如果預(yù)算有限，可以購買磁性支架，如果有更多資金，可以購買臺式移液機器人或 96 或 384 通道移液器，或者使用專用的純化系統(tǒng)。
5.Sephadex® 純化
Sephadex 純化可用于從較小的分子中純化核酸，例如引物、核苷酸或染料。
5.1 它是如何工作的？
Sephadex 是一種凝膠過濾樹脂，由環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)的葡聚糖制成。5 要制備樹脂，您需要將 Sephadex 粉末添加到離心柱中，用水再水合，然后離心柱以去除多余的水。在第二次旋轉(zhuǎn)色譜柱之前，將樣品添加到樹脂頂部。在離心過程中，較大的分子很容易通過樹脂并洗脫，而較小的分子會被困在葡聚糖珠的孔隙中。微珠的尺寸排除能力取決于您選擇的 Sephadex 類型。例如，Sephadex G-25 Medium5可用于純化分子量>5000的核酸，G-50 Medium6適用于分子量>30000的分子。
為了加快這一工作流程，請選擇預(yù)裝 Sephadex 的離心柱，而不是自己創(chuàng)建它們，或者在 96 孔過濾板中工作。
5.2 優(yōu)缺點
就像離心柱純化一樣，該方法可以根據(jù)您的通量需求進行調(diào)整，方法是在離心柱或 96 孔濾板中進行。不存在分子-基質(zhì)結(jié)合步驟還可以防止對核酸造成不必要的損傷，7 使其成為一種相當(dāng)溫和的純化方法。然而，這非常耗時，尤其是在您自己準(zhǔn)備離心柱或過濾板時——Sephadex 必須再水合大約三個小時——而且不能自動化。
5.3 所需設(shè)備
Sephadex 純化所需的唯一設(shè)備是離心機。
6. 酶促方法
如果您的后續(xù)應(yīng)用，一些制造商會提供酶法來清理您的 PCR 產(chǎn)物——例如Sanger 測序、下一代測序或 SNP 分析——要求您的樣品不含未摻入的引物和 dNTP。
6.1 它是如何工作的？
酶促方法僅包括兩個步驟。首先，將酶混合物添加到樣品中，并在 37 °C 下孵育 15 分鐘。在孵育過程中，混合物中的第一種酶，核酸外切酶 I，將消化多余的引物，第二種酶，堿性磷酸酶，將去磷酸化 PCR 期間未消耗的 dNTP。酶發(fā)揮作用后，您可以將樣品加熱到 80 °C 再加熱 15 分鐘以使酶失活。
6.2 優(yōu)缺點
除了快速簡便之外，此方法不會導(dǎo)致樣品損失，并且可以輕松適應(yīng)您的樣品數(shù)量。它唯一的缺點是它只能用于從引物和 dNTPs 中清除 PCR 產(chǎn)物，而不能去除任何其他 cont
7. 結(jié)論
如您所見，每種樣品類型、下游應(yīng)用和預(yù)算都有一種核酸純化方法。 我們希望本文能幫助您確定選擇哪一個來滿足您的特定需求。
如果您來這里不僅是為了了解核酸純化的技巧，您可能還想了解收集樣本、提取核酸、執(zhí)行 PCR 反應(yīng)和量化核酸所需的知識。 當(dāng)我們正在裝備一個新的內(nèi)部實驗室時，我們整理了這個由五部分組成的系列，現(xiàn)在看起來像這樣：
