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怎么做交聯(lián)染色質(zhì)免疫共沉淀（X-ChIP）實(shí)驗(yàn)
Release Time：2020-07-20一、交聯(lián)染色質(zhì)免疫共沉淀（X-ChIP）實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介：
二、交聯(lián)染色質(zhì)免疫共沉淀（X-ChIP）實(shí)驗(yàn)所需材料及試劑：
三、交聯(lián)染色質(zhì)免疫共沉淀（X-ChIP）實(shí)驗(yàn)步驟
1.交聯(lián)和細(xì)胞收獲
甲醛可以使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)。交聯(lián)結(jié)果的質(zhì)量取決于對(duì)交聯(lián)時(shí)間的把握，樣品的交聯(lián)時(shí)間通常為2-30分鐘，過(guò)度的交聯(lián)會(huì)降低抗原結(jié)合和超聲破碎效率?？乖瓫Q定簇也將被掩蓋，添加甘氨酸可以消除甲醛并終止交聯(lián)反應(yīng)。
1.1準(zhǔn)備兩個(gè)充滿細(xì)胞的150cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿（1 * 107-5 * 107個(gè)細(xì)胞/皿），將甲醛直接滴入用PBS洗滌的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使最終濃度達(dá)到0.75％，然后在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)10分鐘以使蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)。
1.2加入甘氨酸使終濃度達(dá)到125mM，并在室溫下振蕩孵育5分鐘。
1.3用10ml預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。
1.4用刮板將收集的細(xì)胞放入5ml的預(yù)冷PBS中，并轉(zhuǎn)移到50ml的試管中。
1.5向培養(yǎng)皿中加入3ml PBS，將剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml管中，并以1000g離心5分鐘。
1.6倒出上清液，并用FA裂解緩沖液（1x107cells /750μl）重懸沉淀。
初始細(xì)胞應(yīng)為1 * 107-5 * 107，并按上述終濃度0.75％甲醛和甘氨酸處理。用預(yù)冷的PBS洗滌3次，以1,000g離心5分鐘，然后用FA裂解緩沖液重懸沉淀。
2超聲波破壞
2.1超聲裂解細(xì)胞懸液可將DNA均勻地破碎成500-1000bp的片段，不同的細(xì)胞系需要不同的超聲時(shí)間才能獲得最佳結(jié)果，應(yīng)通過(guò)時(shí)間梯度超聲選擇交聯(lián)細(xì)胞，以選擇最佳超聲條件，樣品經(jīng)過(guò)時(shí)間梯度，分離DNA，檢測(cè)片段大小序列，并在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。
2.2超聲波破壞后，8000g，30秒，4°C,離心。將上清移入新的管子中，開(kāi)始準(zhǔn)備進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀（IP）。
2.3每個(gè)超聲樣品取50ul，此時(shí)樣品標(biāo)記為INPUT，用于定量DNA濃度和PCR空白對(duì)照。超聲后的染色質(zhì)應(yīng)立即在液氮中冷凍或在-70°C下保存2個(gè)月，避免反復(fù)凍融。
3.檢測(cè)DNA濃度
3.1INPUT樣品用于計(jì)算后續(xù)IP樣品的DNA濃度，DNA可以通過(guò)PCR純化試劑框（添加70ul洗脫液，然后輸入3.2a）或使用苯酚/氯仿萃?。ㄌ砑?50ul洗脫液，然后按照3.2b）2a。加入2ul RNaseA（0.5mg / ml），加熱至65°C，搖動(dòng)4-5小時(shí)或過(guò)夜以反向交聯(lián)，使用PCR純化試劑盒中的制造商說(shuō)明純化DNA，將樣品冷凍并儲(chǔ)存在-20℃，之所以將RNaseA添加到樣品中，是因?yàn)槭褂肞CR純化試劑盒時(shí)高濃度的RNA會(huì)干擾DNA的純化，確定純化柱的飽和度。
3.2加入5ul蛋白酶K（20mg / ml），加熱至65°C并搖動(dòng)4-5小時(shí)或過(guò)夜以反向交聯(lián)，用苯酚/氯仿提取的DNA用乙醇沉淀在10ul糖原（5mg / ml）中，重懸于100ul水中，將樣品冷凍并儲(chǔ)存在-20℃，用蛋白酶K處理樣品，以將相鄰的肽切割成具有羧基的芳族和脂族氨基酸，蛋白質(zhì)和DNA之間的交聯(lián)被DNA純化打斷。
3.3檢測(cè)DNA濃度，將5ul純化的DNA放入995ulTE中，將原始溶液稀釋200倍，并測(cè)量其OD260，則DNA的濃度為OD260x10,000.μg/ ml，可以計(jì)算出染色質(zhì)產(chǎn)物的DNA濃度。
4.免疫共沉淀
4.1對(duì)于從2.2獲得的染色質(zhì)產(chǎn)品，建議每個(gè)IP樣品使用25ug DNA，為每個(gè)樣品添加RIPA溶液的比例為1:10，需要樣品作為空珠的對(duì)照。
4.2將一抗添加到每個(gè)樣品（空珠對(duì)照樣品除外）中，根據(jù)過(guò)去的經(jīng)驗(yàn)添加抗體的量，1-10ug抗體/ 25ugDNA效果更好。
4.3向所有樣品中添加20ul蛋白A / G珠子（之前已超聲處理成單鏈鯡魚精子DNA和BSA吸附，請(qǐng)參見(jiàn)步驟4.3a），在4°C搖動(dòng)IP過(guò)夜，3a蛋白A / G珠和單鏈鯡魚精子DNA，如果同時(shí)使用蛋白A珠和蛋白G珠，則將兩個(gè)珠等量混合，并用RIPA溶液洗滌3次，除去RIPA溶液，添加單鏈鯡魚精子DNA至珠的最終濃度至75ng /μl，然后使用BSA將珠的最終濃度設(shè)定為0.1μg/μl，加入兩倍體積的珠子，并在室溫下孵育30分鐘，用RIPA洗滌一次，然后添加相同體積的RIPA。
4.4將蛋白A / G珠以2000g離心1分鐘，然后除去上清液。
4.5用1ml WashBuffer溶液，2,000g，離心1分鐘洗滌小珠3次，然后除去上清液，6用1ml FinalWashBuffer溶液，2,000g，離心1分鐘洗滌小珠一次，并除去上清液，如果觀察到背景很高可增加洗滌次數(shù)，另外，超聲處理后的染色質(zhì)也可以在步驟4.2之前與蛋白A / G珠一起孵育1小時(shí)，可以通過(guò)此附加步驟除去任何非特異性吸附，將上清液（超聲染色質(zhì)）倒入新管中，使用抗體和珠子。
5.洗脫和反向交聯(lián)
5.1使用120ul ElutionBuffer將蛋白A / G珠添加到蛋白A / G珠中，并在30°C搖動(dòng)15分鐘以洗脫DNA。
5.2以2000g離心1分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新試管中，此時(shí)樣品可在-20°C下冷凍3DNA可通過(guò)PCR純化試劑盒純化或苯酚/氯仿沉淀，4DNA量水平可通過(guò)定量PCR檢測(cè)，引物和探針通?？梢允褂枚縋CR機(jī)上的軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，也可以使用在線設(shè)計(jì)軟件。
四、交聯(lián)染色質(zhì)免疫共沉淀（X-ChIP）實(shí)驗(yàn)所需的試劑清單：
| 序列 | 產(chǎn)品名 | 貨號(hào) | CAS | 備注 |
| 1 | 乙醇 | CCF12679 |
127852-29-3 | |
| 2 | 甲醛 | CCF10222 | 349149-07-1 | |
| 3 | 甘氨酸 | SS3763 | 56-40-6 | |
| 4 | 90mm*20mm 塑料培養(yǎng)皿(滅菌） | FM-90-G | ||
| 5 | 10*10cm方形塑料培養(yǎng)皿(滅菌） | FM-100-F | ||
| 6 | PBS | HC1488 | ||
| 7 | 瓊脂糖 | SF0013 | 9012-36-6 | |
| 8 | 苯酚 | JT24025 | 108-95-2 | |
| 9 | 氯仿 | BDM000285 | 67-66-3 | |
| 10 | RNaseA | HC1334 | ||
| 11 | 蛋白酶K | SS2244 | 39450-01-6 | |
| 12 | RIPA裂解液 | HC1242 |
